神经轴突运动蛋白Kif1a启动子基因全长序列报告基因载体构建

姜 威，任 晴，赖关淑媛，张 欢，张 缨，于 澎，董 铭

驱动蛋白(kinesin)是目前已知最小的分子马达,它能够通过催化作用将三磷酸腺苷(ATP)分子携带的化学能高效地转化为机械能,产生沿微管的连续前进动作,从而完成其携带的细胞器和细胞内物质的运输[1]。驱动蛋白包括一个巨大的马达蛋白超家族(KIF superfamily)。KIF1A 属于kinesin-3家族,在机体内常态以单体形式存在,是一种沿微管正向运动的驱动蛋白马达。与常见的双头驱动蛋白马达相比KIF1A有高度的前进性,实验研究表明:它能以约1.5 μm/s的速度在不脱离微管表面的前提下连续前进约700步,这是普通驱动蛋白在微管表面运动步数的5～6倍。KIF1A最早发现于神经轴突膜泡运输的研究中,基于轴突免疫细胞化学方法的研究表明,快速运动的KIF1A主要负责神经系统里轴突上突触囊泡前体的快速运输,并且它介导的轴突运输对神经的成长、存活和功能发挥有重要的作用[2]。机体内KIF1A 的变异将引起学习记忆功能减弱、癌症、常染色体遗传性痉挛性截瘫、感觉神经元病变等多种神经功能有关的疾病[3],而研究这些病理和开发相关药物与KIF1A 的运动机制有密切的关系。因此,关于KIF1A 的研究已成为生命科学、物理学、生物化学等诸多学科关注的焦点问题之一。本研究旨在构建KIF1A启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究KIF1A基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 大肠杆菌DH5α由本校基础部保存。pGL3 系列荧光素酶基因的表达载体,购自美国promega公司。pGEM-T easy 载体、T4 DNA 连接酶、TaKaRa Prime STARTM HS DNA Polymerase、各种限制性内切酶、电泳所用DL 2000 marker均购自TaKaRa公司。质粒提取、纯化试剂盒E.Z.N.A.TM Plasmid Miniprep Kit I (50 preps)-Q Spin Column Format、以及PCR 片断回收及纯化试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit (50 preps)-Q Spin Column Format和E.Z.N.A.TM Cycle Pure Kit (50 preps)-Q Spin Column Format试剂盒购自美国Omega公司。Dotap 转染试剂购自瑞士Roche 公司。凝胶成像分析系统Gel Doc2000购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank报道的kif1a基因的启动子区1853 bp DNA 序列(GenBank:NC_000002.12 (240713767.240821403,complement)设计引物。用Gene tool软件设计一对特异性引物，5’端和3’端分别引入SacI和XhoI酶切位点。上游引物为F1:5’GCCGACATCTTCTG CCAGTTCA 3’；下游引物为R2:5’GAAGGACTTGGTCACCTCCACT 3’。由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.2.2 SCG细胞的培养 仔鼠出生前日，铺胶。用0.2%PEI覆盖培养皿底物，4 ℃冰箱过夜。Matrigel放冰上置于4 ℃冰箱内，使均匀受冷解冻，避免生成沉淀。仔鼠出生当天，将仔鼠头部倒置固定于解剖台上，镜下沿颈总动脉向头部方向仔细分离，直至发现纺锤样SCG，小心取出SCG，放入置于冰盒上的35 mm dish中(内含L-15液)，将SCG用吸管吸入15 ml试管，加1XTrypsin及Collagenase IV各约1 ml，37 ℃振荡3～4 h，吸走培养皿中0.2% PEI，DDW洗3遍，加入Matrigel，室温放置半小时方可使用。打碎SCG，镜检至成单细胞状态。加等量中和液，900转离心1 min，弃上清，加培养液，悬浮细胞并计数，调整浓度至104个/ml，吸走Matrigel，加入100 μl SCG细胞/培养皿，37 ℃ 1 h等待细胞附壁，补充培养液至1 ml左右，37 ℃ CO2孵箱培养。

1.2.3 kif1a基因启动子模板的制备 本实验室前期已从人神经细胞基因组DNA中,应用PCR技术,克隆出包含kif1a启动子基因全长序列的基因片段(2565 bp) (GenBank:NC_000002.12,240821403-240818837),DNA 测序证实序列正确,并成功构建重组pGEM-T easy载体。用无菌接种环蘸取冻存kif1a重组pGEM-T easy载体质粒菌株,氨苄青霉素LB琼脂培养平板(浓度为50 g/ml) 划线,在37 ℃孵箱中培养过夜，直到菌落长出。用无菌牙签或吸头挑取单个菌落于5 ml含氨苄青霉素抗生素LB 培养基(浓度为50 μg/ml),200～220 r/min,37 ℃过夜。质粒抽提(参照EZNA质粒抽提试剂盒说明书进行)。以重组pGEM-T easy载体质粒为模板,进行目的基因的扩增。

1.2.4 目的基因的扩增 以含有kif1a启动子基因全长序列的重组pGEM-T easy载体模板,以F1、R2为引物,反应体系为50 μl,进行PCR扩增kif1a基因启动子的DNA片断。反应条件为:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s;66 ℃ 15 s;72 ℃ 1 min 30 s,反应共30个循环,72 ℃ 延伸8 min,取5 μl PCR产物在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶(10 g/L)中进行电泳,在紫外灯下观察结果并用凝胶成像分析系统成像。将PCR 产物用低熔点的琼脂糖凝胶(10 g/L)电泳分离后,用EZNA TM Gel Extraction Kit(50 preps)-Q Spin Column 试剂盒回收并纯化。

1.2.5 荧光素酶报告基因载体的构建 感受态大肠杆菌DH5α的制备及连接产物的转化,均按常规方法进行。将纯化的PCR产物及pGL3-basic荧光素酶基因表达载体,分别用SacI和XhoI进行双酶切(6 h),并经低熔点琼脂糖凝胶(10 g/L)电泳分离双酶切产物后,用EZNA TM Cycle Pure Kit (50 preps)-Q Spin Column Format试剂盒回收并纯化。将经双酶切并回收的PCR产物和pGL3-basic 荧光素酶基因表达载体,用T4 DNA连接酶于16 ℃下连接12 h,将kif1a基因的启动子定向插入pGL3-basic荧光素酶基因表达载体中,即构建成pGL3- kif1a表达载体。以连接产物按常规方法转化感受态的大肠杆菌DH5，然后涂布于含有IPTG(200 g/L)、X-gal(20 g/L)、氨苄青霉素(100 mg/L)的LB琼脂平板上,于37 ℃培养14 h。

1.2.6 荧光素酶报告基因载体的酶切、测序鉴定 随机挑取白色菌落,提取质粒后用SacⅠ和XhoⅠ进行双酶切、以重组质粒pGL3-kif1a为模板,应用上游引物F1和下游引物R2,进行PCR 扩增,并进行DNA序列分析(吉林省库美生物科技有限公司完成)。

1.2.7 荧光素酶报告基因载体转染 脂质体法转染SCG细胞，将SCG细胞培养至贴壁面积占瓶底面积60%～80%时,以每孔2×105个细胞移入6孔板内,在37 ℃、5 %CO2培养箱内,以无血清培养基孵育24 h。接种3个孔,分别转染3种质粒,即pGL3-basic(阴性对照)、pGL3- kif1a(重组质粒)及pGL3-promoter(阳性对照,含SV40启动子)。每种质粒的用量均为2.5 μg/孔,PRL为0.05 μg/孔(作为内对照),分别与15 μl脂质体混合后进行转染,详细操作见试剂盒说明书。在相同条件下重复3次转染实验。

1.2.8 荧光素酶报告基因活性的检测 冰浴条件下,足够的冷PBS轻轻漂洗,至少洗4次,倾斜6孔板放置20 min,彻底祛除培养基,加1×PLB 裂解液500 μl,摇床冰浴摇15 min,将裂解液转移到EP管,离心后取上清,立刻检测;100 μl LARII 于96孔板;加入20 μl细胞裂解液,与LARII混匀放入仪器中读数;记录Firefly luc.数值,时间15 s;取出检测管,加100 μl Stop/Glo试剂,涡旋混匀后放入仪器,读数,并记录Renilla luc.数值,时间15 s。

2 结 果

2.1 kif1a基因的启动子全长序列的PCR 扩增 用Gene tool软件设计一对特异性引物，5’端和3’端分别引入SacI和XhoI 酶切位点，显示了酶切位点在载体上的连接位置与方向(见图1)。从本实验室前期构建的包含kif1a启动子基因全长序列的基因片段重组T载体质粒中选择性扩增kif1a启动子,取PCR 产物P进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示,在1853 bp左右处见一特异性条带(见图2),证明扩增成功。

2.2 荧光素酶报告基因载体酶切及PCR 鉴定 重组质粒pGL3-kif1a经SacI和XhoI双酶切后,进行电泳分离,出现大小约为1853 bp的条带(见图3)。以重组质粒pGL3-kif1a为模板,用F1、R2作为引物进行PCR扩增。取PCR产物进行电泳分离,出现大小约为1853 bp的条带。证明pGL3-kif1a启动子报告基因载体构建成功。

2.3 荧光素酶报告基因载体序列分析 对插入pGL3-basic载体的pGL3- kif1a的PCR产物进行序列分析表明，kif1a基因启动子的序列与GenBank中kif1a基因的启动子的序列相一致。

2.4 荧光素酶报告基因载体的活性检测 重组质粒pGL3-kif1a转染SCG细胞后,产生的荧光素酶活性同阴性对照pGL3-basic质粒转染后产生的荧光素酶活性相比较,有显著的启动子活性;但同阳性对照(pGL3-promoter)质粒转染后产生的荧光素酶活性相比较,pGL3-kif1a启动子活性明显低于pGL3-promoter(见图4)。

图1 pGL3-Promoter荧光素酶报告载体限制性内切酶切位点

图2 pGL3-kif1a启动子序列 双酶切1853 bp和5 kb片段。M:DNA Marker DL2000

图3 重组质粒pGL3-kif1a为模板PCR扩增结果。P:PCR扩增产物；M:DNA Marker DL2000

图4 pGL3-kif1a启动子在SCG细胞中启动活性

3 讨 论

KIF1A主要参与轴突上分泌囊泡前体沿微管的正向运输,它的变异可能导致多种神经病变和发育的缺陷,例如阿尔茨海默病、帕金森病、遗传性感觉和自主神经病变Ⅱ型(hereditary sensory and autonomic neuropathy typeⅡ,HSANII)、常染色体隐性遗传性痉挛性截瘫(SPG30)亚型以及和感觉神经功能相关等[3～5]，近年来,人们已对kif1a及其配体的结构和功能进行了深入的研究,但对其转录调控表达机制的研究甚少。关于它在成年动物体内的功能至今仍不完全清楚。为了能对其转录调控表达机制进行深入研究,我们构建了kif1a启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体。基因报告系统已广泛应用于研究真核细胞基因的表达和调控,利用报告系统研究kif1a启动子的调控作用可以最大限度地避免下游基因表达产物对启动子的反馈干扰,能真实地反映外周因素对调控序列的影响。pGL3-basic是一个能表达荧光素酶蛋白的质粒,是研究启动子调控的常用载体[6],其敏感性高且易于表达,与CAT报告基因相比更加适合对基因瞬时表达的研究,从而使其成为研究可诱导系统一种理想的报道分子。KIF1A 的突变可能抑制脑神经干细胞的增殖,并且阻断脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)介导的神经元迁移。同时,研究表明KIF1A与学习、记忆等高级脑功能的调节有关,基于KIF1A的轴突运输能够调节脑的高级功能并反映大脑活动的变化。研究人员在处于富集环境的活体小鼠的海马体和体外海马神经元里,观测到了BDNF增量调节KIF1A和KIF1A物质输运的现象,通过分析发现缺少KIF1A的增量调节将损害富集作用促使的海马体突触发生和学习增强,另外发现高表达的KIF1A通过形成突触前终扣促进突触发生。这些发现表明KIF1A对于在富集环境诱导下BDNF介导的海马体突触发生和学习增强是必不可少的。由于富集环境对大脑的结构和功能有多种影响,所以KIF1A作为一个潜在的改善脑疾病的治疗目标将有重要的研究价值[7]。

此外,KIF1A是老化相关的神经回路功能障碍和胰岛素信号转导调节记忆的一个关键调节器。研究发现当KIF1A功能表达降低时,机体神经回路功能障碍将随年龄增加而加速恶化,相反在KIF1A功能表达上调时,机体的神经回路功能得到了极大的改善并且寿命也有所延长。同时,针对与记忆和学习相关的测试,KIF1A功能表达上调的实验动物的表现要好于未上调动物的表现。另外,研究还发现在KIF1A对胰岛素信号通路下调起到必要的保护作用。这些发现使得当以维持机体健康为目的时,与KIF1A有关的轴突运输已成为药物干预的一个潜在目标[8]。令人惊异的是 KIF1A还与一些癌症有关。与它在神经传输中的功能一致,KIF1A可能是检测神经母细胞瘤的一项指标,而且它也是鼻咽癌的一个潜在肿瘤抑制物,此外其启动子区域的甲基化是肺癌的一项指标[9,10]。考虑到KIF1A在生命过程和一些疾病中的重要作用,研发基于KIF1A的药物和治疗方案也是科研工作者的一个重要选项,而这一切必须以阐明KIF1A的运动机制为出发点,这也是目前研究的热点问题之一。

因此我们应用PCR技术从人基因组DNA克隆出包含kif1a启动子序列的基因片段,构建过度T 载体,再以T载体为模板构建kif1a基因全长序列报告基因载体pGL3-kif1a,并转染人SCG细胞,结果表明,pGL3-kif1a启动子在人SCG细胞中具有明显的转录活性。总之,kif1a荧光素酶报告基因载体pGL3-kif1a的成功构建,为体外研究kif1a启动子转录调节提供了新的手段。为下一步我们将研究该基因核心启动子区、启动子区重要的顺式调控元件和相关的反式作用因子以及该基因对于诱导信号的应答机制奠定基础。