超高效液相色谱-高分辨质谱测定白酒中氨基甲酸乙酯含量

熊晓通，胡 峰，尤小龙，尹艳艳，陈明学，程平言，钟方达

（贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州 习水 564622）

近年来，随着酱酒热的持续升温，酱香型白酒也越来越受到消费者的青睐[1-2]。而氨基甲酸乙酯（ehthy carbamate，EC）作为酱香白酒发酵过程中产生的一种天然有害致癌物质[3]，在各种香型白酒中均普遍存在[4]，虽在白酒领域已取得了酿造过程中EC产生机理的研究成果[5-6]，并针对一些工艺环节实施了对EC含量的控制[7-8]，但因人工干预环节的有限性，仍然难以彻底杜绝EC的安全隐患[9]，并且根据国内外相关研究，白酒中的主要成分乙醇也会加大EC的致癌性[10]，故EC产生的食品安全风险隐患已成为白酒行业关注的热点问题之一[11-14]。虽然国内暂未出台EC的相关限量标准，但加拿大、捷克、法国等国家早已规定蒸馏烈酒中EC质量浓度不得超过150 μg/L[15-17]。

目前，薄层分析法[18]、液相色谱法[19]、气相色谱分析法[20]、气相色谱-串联质谱法[21]、近红外光谱法[22]等是常用的EC检测方法。上述几种方法存在样品前处理过程繁琐、需要消耗大量药品和有机溶剂、基质干扰较大、样品检测效率不高等缺点，不利于人体健康、环境和检测成本控制[23]。随着检测设备的不断更新换代，新的检测技术也被广泛应用[24-25]，其中超高效液相色谱-高分辨质谱检测技术检测酱香白酒中EC含量时具有前处理方便快捷、基质效应较低、抗干扰能力强、分辨率高、灵敏度高、准确度高等优点，国内外相关文献报道也并不多见[26-27]。因此，本研究拟建立酱香白酒中EC含量的超高效液相色谱-高分辨质谱一级子离子定量法，该方法旨在有效去除基质干扰，灵敏度高，检测分析速度较快，在酱香白酒EC监控过程中取得良好效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验酒样为贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司酱香成品酒以及市购酱香型白酒。

EC标准品（纯度≥98.5%） 德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸（均为色谱纯） 美国Fisher公司；实验用水均为艾科浦超纯水机制备的超纯水。

1.2 仪器与设备

Q Exactive Focus高分辨质谱仪（配备可加热电喷雾电离源） 美国Thermo公司；UltiMate 3000超高效液相色谱仪 美国Dionex公司；万分之一电子天平美国Ohaus公司；BPG型精密鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；涡旋振荡器 上海琪特分析仪器有限公司；全智能超纯水机 美国艾科浦公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液：称取一定量EC标准品于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成质量浓度为122 mg/L的标准储备液，并放置于4 ℃冰箱中贮存待用。

标准系列溶液：准确量取1 mL标准储备液于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成质量浓度为1 220 μg/L的标准中间液，再逐级稀释至12.2、36.6、61、122、244 μg/L的标准系列溶液，并放置于4 ℃冰箱中贮存，待用。

1.3.2 样品前处理

标准系列溶液前处理：系列溶液过0.22 μm水相微孔滤膜后直接上机检测。

酒样前处理：准确吸取1 mL酒样于离心管中，置于80 ℃烘箱中烘至0.2～0.4 mL后取出，冷却后加水定容至1 mL，涡旋混匀，过0.22 μm水相微孔滤膜，上机检测。

1.3.3 分析条件

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：Accucore aQ液相色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱温：35 ℃；流动相：A相为体积分数为0.1%甲酸溶液，B相为甲醇；进样温度：4 ℃；进样体积：10 μL；洗脱方式：采用梯度洗脱（表1）。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.3.2 质谱条件

离子源：可加热大气压电喷雾电离源，正离子扫描模式；扫描类型：选择离子检测模式；扫描范围m/z55～95；分辨率70 000；自动增益控制目标离子数1×106；最大注入时间5 ms；鞘气流速30 arb；辅助气流速15 arb；喷雾电压2.3 kV；离子传输管温度350 ℃；S-lens RF evel：80；辅助气加热温度200 ℃。

2 结果与分析

2.1 子离子的确定

王成龙等[28]以m/z62.02作为EC的定量子离子，运用高效液相色谱-高分辨质谱仪建立了平行反应监测二级子离子全扫描模式，对白酒中EC进行二级子离子定量。本研究运用一级全扫自动触发二级模式对122 μg/L EC标准溶液进行数据采集，得到EC的一级母离子色谱图（图1），发现若采用一级母离子定量，其基质干扰较为严重，检出限较高。EC母离子在高能量碰撞解离池中，被10 eV的碰撞能量打碎后，提取出EC的二级质谱图（图2），虽然m/z62.02的相对丰度最大，但响应值也只有1.78×104。在相同色谱条件下，运用平行反应监测二级子离子全扫描模式高能量碰撞解离池（碰撞能量为10 eV）对122 μg/L EC标准溶液进行数据采集，将图2中离子进行逐个提峰，仅m/z62.02的离子所提取的峰（图3）与图1匹配效果较好，若采用二级子离子定量，虽消除了基质干扰，但其响应值较低，仅为5.24×104。

图1 122 μg/L EC标准溶液一级母离子色谱图Fig. 1 Primary parent ion chromatogram of EC standard solution at 122 μg/L

图2 122 μg/L EC标准溶液二级质谱图Fig. 2 Secondary mass spectrum of EC standard solution at 122 μg/L

图3 122 μg/L EC标准溶液二级子离子色谱图Fig. 3 Secondary daughter ion chromatogram of EC standard solution at 122 μg/L

图4 EC母离子生成m/z 62.02离子模拟裂解图Fig. 4 Simulated fragmentation of EC parent ions into m/z 62.02

据相关报道，m/z62.02的碎片离子为[EC＋H]+脱掉C2H4基团后形成的[29]，为进一步确认m/z62.02的碎片离子为EC的子离子，本研究使用Mass Frontier 7.0 软件对EC母离子进行了模拟裂解，得到了生成m/z62.02离子的3 种可能途径（图4）。因此，m/z62.02的离子为EC的特征子离子，这与王成龙等[28]的研究报道一致。

2.2 质谱条件优化

为解决一级母离子定量基质干扰严重和二级子离子定量响应较低问题，本研究使用进样针吸取一定量122 μg/L EC标准溶液（100 μL/min）与流动相（45%的A相、55%的B相，0.05 mL/min）通过三通阀混合后经离子源直接进质谱进行一级全扫，得到优化前的一级质谱图（图5A），发现EC出现源内裂解现象，同时出现m/z90.05的母离子以及m/z62.02的特征碎片子离子，这为EC一级子离子定量的可行性提供了依据。通过调节质谱参数以提高m/z62.02子离子的响应值，从而确定了最大注入时间、S-lens RF level两个主要影响因素。通过降低最大注入时间和提高S-lens RF level参数可明显增加子离子的响应值，其余参数均使用仪器默认值或厂家推荐值，从而确定1.3.3.2节优化后的质谱条件，继而得到优化后的一级质谱图（图5B）。其中m/z62.02子离子优化前的响应值为4.52×105，经优化后变为1.50×106，提高了2.32 倍。相较于二级扫描模式下，m/z62.02子离子响应值提升了2 个数量级。

图5 EC质谱条件优化前（A）、后（B）一级质谱图Fig. 5 Primary mass spectra of EC before (A) and after (B)optimization of mass spectral conditions

2.3 色谱条件选择

采用1.3.3.2节的质谱参数，在0.1%甲酸溶液-甲醇的流动相体系下，分别考察SyncronisHilic色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Hypersil GOLD Amino色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）以及Accucore aQ色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）对EC分离效果的影响（图6）。结果表明，同一浓度EC标准溶液在SyncronisHilic柱中出峰时间为1.13 min，保留时间较短，容易受基质干扰影响。在Hypersil GOLD Amino柱中虽有一定保留，但响应值较低，灵敏度不高。在Accucore aQ柱中不仅保留时间较长，响应值也较高，取得较好的分析效果。因此，选择Accucore aQ色谱柱作为分析柱。

图6 不同色谱柱下122 μg/L EC标准溶液一级子离子色谱图Fig. 6 Primary daughter ion chromatograms of EC standard solution at 122 μg/L using different columns

2.4 方法评价

2.4.1 线性范围、检出限和定量限

本实验根据酱香白酒中EC的实际含量确定1.3.1节中的标准系列溶液，按1.3.3节的分析条件对标准系列溶液进行上机检测，以EC质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性拟合，得标准曲线方程：Y=3 788.24＋67 210X，R2=0.999 5，线性范围12.2～244 μg/L。以信噪比为3和10分别确定方法的检出限和定量限，检出限为0.95 μg/L，定量限为3.17 μg/L。

2.4.2 回收率和精密度实验结果

分别选取38%、42%、53%的酱香型白酒，加标量为10、50、100 μg/L，在1.3.3节分析条件下，对加标样品进行前处理后上机检测。每个加标样品做6 次平行实验，计算样品回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），不同乙醇体积分数的酱香型白酒加标回收率在83.46%～106.79%之间；对此方法的精密度进行考察，其中EC测定结果RSD为0.67%～3.54%，均小于5%，完全符合方法精密度要求，结果如表2所示。

表2 不同乙醇体积分数酱香型白酒加标回收率和RSD（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviation of EC in spiked Maotai-flavor Baijiu with different alcohol contents (n= 6)

2.5 实际样品的测定结果

选取不同品牌市售的53%酱香型白酒进行分析检测，每个酒样重复检测6 次，均不同程度检出了EC，平均质量浓度为105.25 μg/L，测定结果RSD均小于5%，结果如表3所示。

表3 不同品牌酱香型白酒中EC含量（n=6）Table 3 EC contents in different brands of Maotai-flavor Baijiu (n= 6)

3 结 论

本研究运用EC在高分辨质谱仪一级全扫模式下出现源内裂解的性质，建立了检测酱香型白酒中EC含量的超高效液相色谱-高分辨质谱一级子离子定量法。该方法不仅解决了一级母离子定量基质干扰严重、检出限较高的问题，还克服了二级子离子定量响应较低的难题。方法前处理也相对简单，酒样仅需烘箱内挥发除乙醇后定容即可，测定过程在10 min内便可完成，具有分析速度快、响应值高、准确度高等优点。酱香型白酒馏酒温度高，部分产品尤其是高端产品中EC含量较低[30-31]，本方法检出限为0.95 μg/L，定量限为3.17 μg/L，可以满足应用于EC含量较低的酱香型白酒产品EC的定量测定，最大限度降低EC产生的食品安全风险，同时高效便捷的实验步骤可实现酱香型白酒产品中EC的大量检测。