贵州铜仁梵净山地区绿茶的产地溯源

张明露，黄聪薇，黎礼科，肖一璇，余海游，赵泰然，尹 杰,*

（1.贵州大学茶学院，贵州 贵阳 550025；2.中国农业科学院茶叶研究所，农业农村部茶叶产品质量安全风险评估实验室，浙江 杭州 310008；3.贵州省农业农村厅，贵州 贵阳 550025；4.贵州省铜仁市农业农村局，贵州 铜仁 554300）

茶叶中含有多种矿质元素，对茶树生长发育和维持人体正常生命活动具有举足轻重的作用[1]。但是，由于不同茶树种植区土壤中元素的组成和含量，受当地地质条件、种植管理和加工方式等多种因素影响，加之茶树对土壤中元素吸收和富集具有选择性，使茶叶中的元素含量具有一定的地域差异[2]。随着环境污染加剧，化肥、农药使用不合理、加工机械合金材料的选择以及加工过程未实现清洁化生产等，有毒有害的重金属元素如Pb、As、Cr、Co和稀土元素的污染对茶叶质量安全带来的风险引起广泛关注[3-4]。因此，通过分析茶叶中元素组成和含量，有利于该地茶叶质量安全和品质评价，了解该产地茶树种植土壤条件和产地特征，对该地区茶树施肥用药、茶叶营养价值和饮用安全具有理论指导意义，同时，小范围产地区域的精细判别也为茶叶质量安全生产追溯提供一定的方法支持。

章剑扬等[4]对浙江省十大名茶样品中稀土元素、As、Cr、Cd和Pb含量进行测定，并对不同茶类间各元素含量差异和各重金属含量之间的关系进行分析，结果表明，所有样品中主要重金属含量未超出国家相关限量标准，Cr、Cd、Pb和稀土元素含量在各类茶中差异显著。吕海鹏等[5]分析4 个不同产地和不同等级的7 个晒青毛茶和25 个普洱茶中16 种矿质元素，其中，Na、K、Ca、Zn、Mn、Fe、Al、Mg、Ni和Co共10 种矿质元素在普洱茶中含量显著高于晒青毛茶，不同产地普洱茶中K、S、Ca、Fe、Al、Mg、Ni和Co含量差异显著，不同等级的普洱茶中矿质元素含量则无显著差异。但是，董喆等[6]通过测定不同季节、不同嫩度的信阳毛尖中8 种矿质元素含量，认为不同等级的信阳毛尖中矿质元素含量具有一定差异性，通过主成分分析（principal components analysis，PCA）法分析其与茶叶品质的关系，构建可客观评价信阳毛尖茶叶质量的模型。同时，电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）分析法因具有快速、高效、检出限低等优点，较广泛应用于茶叶[7-9]、中药材[10]、啤酒花[11-12]、葡萄酒[13-14]、花椒[15-16]、乳制品[17]和肉类食品[18]等产品中矿质元素的检测。

贵州省是全国茶园面积最大的省份，截止2019年底，全省茶园面积达700万 亩，其中铜仁市位于贵州省东北部，地处我国武陵山区，是贵州省茶叶主产区之一，江口、思南、石阡、沿河等主产县茶园面积达158万 亩，位居贵州省第二，产量约占全省30%。对该市茶叶中微量元素的检测及小范围区域产区精细判别，有助于了解全省茶叶质量安全现状和开展全省茶叶产地追溯可行性的研究。

因此，本实验采用ICP-MS测定铜仁市4 个主产县（江口县、石阡县、思南县、沿河县）所产42 个绿茶茶样中31 种微量元素含量，结合相关性分析、PCA、逐步线性判别分析（stepwise linear discriminant analysis，S-LDA）和正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等方法，以期为该地茶叶质量安全性、茶园肥培管理和小区域产地溯源等提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

共采集贵州省铜仁市4 个茶叶主产县42 个绿茶茶样（表1），所有茶样均为2019年市售春茶，基本工艺流程为鲜叶-杀青-揉捻-（做形）-干燥。茶样均在0 ℃条件下密封贮存。

表1 采集地相关信息和样品数Table 1 Information about tea samples collected in this study

重金属元素单标铬（Cr）、钴（Co）、硒（Se）、钼（Mo）、银（Ag）、钡（Ba）、镍（Ni）、铜（Cu）、砷（As）、铁（Fe）、铅（Pb）、锌（Zn）、铝（Al）和锰（Mn），稀土元素单标钪（Sc）、钇（Y）、镧（La）、铈（Ce）、镨（Pr）、钕（Nd）、钐（Sm）、铕（Eu）、钆（Gd）、铽（Tb）、镝（Dy）、钬（Ho）、铒（Er）、铥（Tm）、镱（Yb）、镥（Lu） 国家有色金属及电子材料分析测试中心；含有镉（Cd）混合标液、内标 美国Sigma公司；硝酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

X-Series 2 ICP-MS仪 美国赛默飞世尔科技公司；MARS X-Press型微波消解仪 美国CEM公司；BHW-09C赶酸器 成都英泰尔科技有限公司；超纯水系统美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将茶样充分磨碎，称取0.400 g置于聚四氟乙烯微波消解管中，加入5 mL 15.2 mol/L HNO3溶液，放入微波消解仪，在180 ℃条件下消解40 min，然后在赶酸器上加热赶酸至约1 mL，冷却后以0.3 mol/L硝酸溶液将样品转移定容至25 mL，空白样品同法处理。每个样品做3 个平行。

1.3.2 仪器参数

ICP-MS工作条件：射频功率1 290 W；载气流速、辅助气流速和补助流速分别为1.0、0.98 L/min和1.0 L/min；采样深度8.0 mm；数据采集模式为跳峰模式；积分时间0.01 s；重复采集数据3 次。

1.4 数据处理

利用SPSS 20.0统计分析软件进行方差分析、相关性分析和S-LDA；SIMCA-P 14.1软件进行PCA和OPLS-DA。

2 结果与分析

2.1 铜仁市绿茶茶样中微量元素含量分析

2.1.1 15 种微量元素含量分析

表2 铜仁市绿茶中微量元素含量Table 2 Microelements contents of green tea samples collected from different producing regions

如表2所示，比较各产区茶样中15 种微量元素平均含量，其中，Al、Mn、Fe、Zn等元素含量较高，平均含量分别为707.69、646.80、143.96、50.54 mg/kg。茶树是一种典型的富铝植物，Al可以促进茶树的光合作用和生长发育、参与儿茶素类物质的合成、影响其他元素的吸收和利用等[1]，但含量过高对人体健康具有一定的威胁。目前不同产地、不同茶类中Al的平均含量为175.75～2 028.60 mg/kg[2,19-20]，相比较，铜仁地区茶叶中Al含量属于中等水平，但各产区之间含量差异较大。Mn、Fe和Zn不仅参与茶树很多生理代谢过程，而且在人体维持新陈代谢、机体功能和提高免疫力等方面起着重要作用。与山东[21-22]、河南信阳[6]、江苏[8]和浙江泰顺[23]等产地所产绿茶中元素含量相比，贵州铜仁样品中Zn含量较高，Mn和Fe含量属中等水平；与贵州省内安顺、黔东南州雷山、黔西南州和遵义等地所产绿茶相比[24-25]，Fe含量较高，Mn含量较低，Zn含量居中。除此之外，所测茶样中还含有Cu、Ni、Co、Cr、Se、Mo等人体必需微量元素。

对所有茶样中Cd、Pb、As、Cr和Cu等重金属进行测定分析后发现，Pb含量范围为0.22～0.34 mg/kg，远低于GB 2762—2017《食品中污染物限量》[26]对茶叶中Pb的限量标准（≤5.0 mg/kg）；Cr、Cd和As含量范围分别为0.36～0.67、0.032～0.083 mg/kg和0.047～0.063 mg/kg，均符合农业部相关限量标准（NY 659—2003《茶叶中铬、镉、汞、砷及氟化物限量》）[27]要求（Cr限量标准≤5.0 mg/kg、Cd限量标准≤1.0 mg/kg和As限量标准≤2.0 mg/kg）。Cu含量范围为13.16～14.68 mg/kg，满足农业部规定有机茶限量（NY/T 288—2018《绿色食品 茶叶》）[28]中Cu的限量标准（≤30.0 mg/kg）。

统计分析结果表明，Cr、As、Se、Ba、Pb、Fe、Ni、Cu和Mn元素含量在各产区之间无显著性差异（P＞0.05），其余6 种元素（Co、Mo、Ag、Cd、Zn和Al）含量在不同产区茶样之间差异显著（P＜0.05）。其中，Co和Mo含量由高到低依次为思南县、石阡县、沿河县、江口县，Mo的最高含量与最低含量间相差21.51 倍；Ag含量则为江口县＞沿河县＞思南县＞石阡县，江口县样品中的平均含量与石阡县样品中的平均含量相差6.5 倍；Cd含量依次为思南县＞沿河县＞石阡县＞江口县；Zn含量为江口县＞石阡县＞沿河县＞思南县；Al含量则为思南县＞江口县＞石阡县＞沿河县。

2.1.2 稀土元素含量分析

表3 铜仁市绿茶中稀土元素含量Table 3 Rare element contents of green tea samples collected from different producing regions

从表3可知，42 个绿茶茶样中各稀土元素含量范围为0.001～0.118 mg/kg，各稀土元素总量由高到低分别为Ce、La、Y、Nd、Sc、Pr、Gd、Sm、Dy、Eu、Er、Yb、Ho、Tb、Tm和Lu，表明茶树对稀土富集具有选择性，以Ce、La、Y、Nd和Sc积累为主，与王雪萍[29]、方志清[30]等的研究结果一致。4 个产地茶样中稀土总含量为1.36 mg/kg，与冉登培等[24]检测结果相近（1.442 mg/kg），从高到低分别为沿河县、思南县、石阡县和江口县，其中，江口县、石阡县和思南县的茶样中未检测出Tm和Lu元素，同时，江口县的茶样也未检测出Tb元素。统计分析表明，Ce、La和Eu元素在各产区茶样之间不存在显著差异（P＞0.05），其余13 种稀土元素含量在不同产区茶样之间差异显著（P＜0.05），说明茶叶中稀土元素的组成与其种植环境地质密切相关，茶园土壤是茶叶中稀土元素主要来源之一[31]。

2.2 元素相关性分析

图1 不同产区绿茶中31 种元素之间的相关性热图Fig. 1 Heat map showing correlation between 31 elements in green tea samples collected from different producing regions

对茶样中31 种微量元素进行Pearson相关性分析（图1），16 种稀土元素中，除Sc外，其余15 种稀土元素相互之间呈现极显著正相关关系，说明这些元素之间具有较强的协同作用。除稀土元素以外的15 种微量元素中，Pb、As、Cr、Fe和Al与其他元素之间只存在极显著正相关或显著正相关；Ba与Mn、Cd和部分稀土元素；Se与Zn和Cd；Ag与Se和Zn；Ni、Cu和Zn之间；Cd与Mn、Mo和Co；Co与Mn、Mo都存在正相关或显著正相关。表明茶树在富集上述元素时，元素之间具有一定的协同、相互促进吸收的关系。

另外，15 种稀土元素（除Sc外）与Zn和Ni；S与Se；Co与大部分稀土元素；Ag与Cd、Co和Mo；Ni与Mn和Ba；Cu与Tm、Lu、Tb和Eu；Zn与Cd、Mo、Ba和Mn存在负相关或显著负相关，揭示这些元素之间呈现相互抑制、拮抗的关系。

2.3 铜仁市绿茶溯源分析

2.3.1 PCA结果

图2 基于PCA前3 个PC构建的绿茶样品散点图Fig. 2 Three-dimensional PCA scatter plot of first three principle components for green tea samples

PCA通过线性变换进行降维处理，以较少的指标反映尽可能多的信息，并对具有代表性的PC数据进行可视化[14,32]。对样品中具有显著差异的19 种元素（P＜0.05）进行PCA，选取特征值大于1的成分作为PC，结果表明，前4 个PC（PC1～PC4）的方差贡献率分别为60.30%、14.49%、10.68%、6.26%，累计方差贡献率达到91.73%，能够达到充分反映原始数据信息的目的。PC1主要由Lu、Y、Tb、Ho、Tm和Yb元素构成，PC2主要由Co和Mo元素构成，PC3主要由Co、Ag、Lu、Al和Cd元素构成。以PC1、PC2和PC3的得分作3D图，从图2可以看出，各个产区的样品有聚类的趋势，但是除了江口县的样品可区分，其余3 个产区的样品均有重叠现象。表明用PCA构建模型未能将这4 个产区的样品有效区分，但利用特征元素进行茶叶小区域产地溯源是可行的。

2.3.2 S-LDA结果

采用S-LDA对4 个产区绿茶元素含量进行判别分析。选取19 种具有显著差异性的元素（P＜0.05）作为变量纳入模型，结果表明，其中7 种元素（Sc、Ag、Cd、Tm、Yb、Zn、Al）被判别模型保留作为判别指标，同时，根据Wilks’λ值构建了3 个判别函数。这3 个函数解释了100%变异（判别函数F1、F2和F3分别解释了所有变异的62.1%、25.7%和12.2%）。典型相关系数分别为0.923、0.838和0.728，类间差异显著（p1、p2和p3均小于0）[2]，表明判别结果有效。基于所选7 个元素构建判别函数如下：

图3 基于S-LDA前2 个PC构建的绿茶样品散点图Fig. 3 S-LDA scatter plot of first two principal components for green tea samples

利用判别函数F1和F2对4 个产地的样品分类，如图3所示，4 个产区的样品基本可以区分开，江口县、思南县和石阡县相互之间可以完全区分，但沿河县与思南县和石阡县有小部分重叠。进一步将这7 种元素作为判别指标，采用正交验证法对判别模型进行验证，结果见表4，对42 个已知样本的回判正确率为90.5%，交叉验证成功率为83.3%，可将这7 种元素作为该4 个产地识别的判断指标。4 个产地的Fisher线性判别式函数如下：

表4 S-LDA对不同产区铜仁绿茶产地溯源的判别结果Table 4 Correct discrimination rates of green tea samples from different producing regions in Tongren city by S-LDA model

2.3.3 OPLS-DA结果

对于样本量小和自变量较少的数据，采用OPLSDA具有一定优势。以19 种具有显著差异的元素（P＜0.05）含量作为特征变量建立统计模型，统计量分别为说明97%的变量可解释73.7%的组间差异；Q2=0.617，证明该模型具有较好的预测能力（R2和Q2均大于0.5）。变量对变异权重参数（variable importance in projection，VIP）值如图4所示，VIP值可以量化每个变量对分类的贡献，VIP值越大（＞1），对地域判别的差异性越显著[33]，6 种元素（Mo、Lu、Al、Ag、Tm和Co）的VIP值大于1，说明上述6 种元素在4 个产区样品中具有显著差异，尤其是Mo、Lu和Al的VIP值分别为1.776、1.586和1.493，表明这3 种元素可作为4 个产区样品鉴别的特征元素。不同区域绿茶样本散点图如图5所示，4 个产区的样品中，思南县和沿河县的样品仍有小部分重叠，表明这2 个产区可能具有相似的地质条件、生态气候和茶园栽培管理方法，后续可进一步探究这2 个产区茶园土壤、茶树品种等的异同性。该方法的正确判别率为92.86%（表5），其中，石阡县的茶样判别率为100%，高于S-LDA法的85.7%（表4），表明该模型的准确度较高。

图4 19 种具有显著差异元素的VIP值Fig. 4 Variable importance in the projection (VIP) obtained from the OPLS-DA mode

图5 前2 个PC的OPLS-DA得分图Fig. 5 OPLS-DA score plot of first two principle components

表5 OPLS-DA对不同产区铜仁绿茶产地溯源的判别结果Table 5 Correct discrimination rates of green tea samples collected from different producing regions in Tongren city by OPLS-DA model

3 结 论

贵州省铜仁市江口县、石阡县、思南县和沿河县的42 个绿茶茶样中Al、Mn、Fe和Zn等元素含量较高；Cd、Pb、As、Cr和Cu等重金属含量较低，均未超出国家或行业标准限量值；样品中的稀土元素总量较低，其中，江口县样品未检出Tm、Lu和Tb，石阡县和思南县的茶样中未检测出Tm和Lu元素。

根据相关性分析表明，此次所测定的31 种微量元素之间存在相互协同或者拮抗的关系，特别是稀土元素之间存在极显著正相关关系，说明在茶树生长过程中，这些元素的吸收和利用是相互影响的，其相互作用的原理有待进一步研究。

利用PCA、S-LDA和OPLS-DA对4 个产区的样品进行判别，结果表明PCA无法有效区分4 个产区样品；S-LDA判别正确率为90.5%，交叉验证准确判别率为83.3%；OPLS-DA的判别最佳，正确率为92.86%，由此说明元素含量测定结合多元统计分析可有效实现茶叶小范围产地区域的正确区分。其中，采用S-LDA方法对江口县和思南县的判别准确率可达到100%，OPLS-DA则可将江口县和石阡县的样品100%准确识别。因此，可进一步结合S-LDA与OPLS-DA，筛选贡献率较大的指标构建新的模型，提高判别准确率，为茶叶小区域溯源及质量安全可追溯性提供一定的理论依据。