肉眼读取-荧光微球竞争免疫层析法半定量快速检测保健食品中的西布曲明

谭贵良，潘子强，张世伟，胡 敏，冯荣虎，杨懋勋

（1.电子科技大学中山学院，广东 中山 528402；2.深圳市计量质量检测研究院，广东 深圳 518102；3.广东省生态环境技术研究所，广东 广州 510650；4.广东江门中医药职业学院，广东 江门 529030）

西布曲明作为一种合成类减肥药，化学式为C17H26ClN，在临床医学上主要用于肥胖症的治疗，通过控制神经中枢抑制食欲。主要作用机制是抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的再摄取，增加突触间隙去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的浓度，进而使下丘脑饱食中枢兴奋，抑制食欲，降低碳水化合物的吸收，减轻体质量[1-2]。长期服用西布曲明可导致眩晕、抑郁、焦虑和协调功能下降等严重精神症状，甚至具有非致死性心脏病发作、非致死性中风等严重心血管疾病风险[3-4]。《中华人民共和国食品安全法》第三十八条明确规定，生产经营的食品中不得添加药品，即不得在保健食品中添加药物成分。然而由于西布曲明良好的减肥效果，导致减肥类保健食品特别是网络出售的减肥类食品中非法添加西布曲明的案例屡见不鲜。

目前国内外检测西布曲明及其类似物的方法主要有液相色谱法[5]、液相色谱-质谱联用法[6-8]、离子迁移谱法[9-10]、离子迁移谱-质谱联用法[11]、流动注射电化学发光法[12]、毛细管电泳法[13]、红外光谱法[14-15]等。尽管这些方法能够检测西布曲明及其类似物，但所用仪器大多昂贵，样品需前处理，耗时长，对环境有污染。基于抗原、抗体特异性反应的免疫层析方法以其低成本、便捷等优点，成为当前食品安全快速检测领域中常用的分析方法，广泛应用于毒素、兽药等的快速检测[16-18]。基于免疫层析方法检测西布曲明鲜见报道，Suryoprabowo等[19]建立基于胶体金的西布曲明免疫层析检测方法，用于减肥茶和咖啡中西布曲明的定性快速检测。

近年来随着标记材料的发展，免疫层析法迈入定量检测阶段[20-22]。然而这些量化数据仍然需要专门的扫描仪进行读取，仪器不便携带且增加了检测成本。不借助仪器对目标物进行量化分析正成为当前一个新的研究热点。近期有研究通过设置多条包被有捕捉抗体的T线，实现了与待测物正相关的梯度显色，从而分别建立降钙素原和马铃薯病毒X的免疫层析半定量检测方法[23-24]。然而该方法必须使用2 个抗体识别一个待测物，不适合于西布曲明等小分子检测。Fu Xiaoxiang等[25]认为通过不断稀释，实验得出达到方法检出限所需的稀释倍数，也可估算出待测物浓度，缺点是过于耗时。竞争免疫层析方法作为包被抗原、抗体和待测物共同组成的三元体系，通过梯度减少抗体浓度，可改变方法的灵敏度。基于此原理，本研究提出一种新的西布曲明免疫层析检测模式，通过设置4 条包被有抗原的检测线，梯度降低抗体的反应浓度，在单一试纸条构建多级灵敏度的免疫反应，结合荧光纳米颗粒（荧光微球）[26-27]的高灵敏特性，构建基于普通荧光手电照射肉眼直接读取的西布曲明免疫层析半定量检测方法，检测模式及原理见图1。本方法是荧光微球竞争免疫层析技术在西布曲明检测中的首次应用。

图1 西布曲明目视读取-免疫层析检测法及试纸条结构示意图Fig. 1 Schematic diagram of the fluorescent immunochromatography combined with naked eye reading for semi-quantitative assay of sibutramine

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硝酸纤维（nitrocellulose，NC）膜、荧光硅球垫、样品垫、吸水纸、PVC底板 美国Millipore公司；氨基修饰的荧光微球（材质为聚苯乙烯）（直径0.2 μm、激发波长488 nm，发射波长525 nm） 上海辉质生物科技有限公司；西布曲明类标准品（西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明、苄基西布曲明、豪莫西布曲明） 加拿大TRC公司；其他试剂均为国产分析纯；西布曲明单克隆抗体和西布曲明抗原 深圳市三方圆生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

图片拍摄使用智能手机，摄像头覆盖（540±25）nm滤光片（美国BioTek公司）；（470±30）nm 100 mW LED荧光手电筒 浙江隆业电器科技有限公司；XYZ3100点膜仪 美国Bio-Dot公司；Milli-Q水处理系统 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 西布曲明抗体-荧光微球偶联物制备

将荧光微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按1∶1∶1的比例投料，并加入1 000 倍质量的去离子水。活化过夜后，离心去除上清液加入pH 7.4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬。以保护标记法[28]将荧光微球偶联至西布曲明抗体。标记完成后，西布曲明抗体-荧光微球偶联物离心去除上清液，加入复溶液（含1% BSA、2%蔗糖、0.05% PEG 20000、0.5% Tween-20、0.1% proclin 300的0.01 mol/L pH 7.4 PBS）重悬抗体-荧光微球偶联物。在聚苯乙烯微孔中加入2 μg西布曲明抗体-荧光微球偶联物（以荧光微球质量计），冻干后作为反应杯。

1.3.2 荧光试纸条的制备

荧光试纸条如图1所示。将西布曲明包被抗原（0.2 mg/mL）按图1所示划4 条平行线于NC膜上，从上到下分别记为检测1～4线。于37 ℃真空干燥12 h，室温真空干燥12 h。最后将吸水纸和NC膜贴在PVC底板上，用自动切条机切成4 mm宽的试纸条，室温条件下真空干燥，备用。

1.3.3 试纸使用方法及检出限

在反应杯中加入100 μL样品液体，搅拌均匀，在不小于15 ℃的室温环境中反应5 min。将微孔中的液体转移至检测卡的加样孔中，层析10 min，荧光手电照射后观察结果。4 条检测线同时显色结果为阴性，检测1线消失时结果为阳性。用不同质量浓度的西布曲明标准溶液滴加到检测卡上，分别记录检测1～4线消失的质量浓度为标志参考，其中仅检测1线刚好消失的质量浓度为该试纸检测方法的检出限。

1.3.4 前处理及上样

取样品1.00 g，加入9 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS中，沉淀5 min（或2 000×g离心1 min），取上清液100 μL为待测液，加入到反应杯中，反应后上样，进行免疫层析分析。

1.3.5 真实样品的方法比对

使用本研究建立的方法和BJS 201701《食品中西布曲明等化合物的测定》[29]规定的液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）法，对网络采购声称有减肥功效的50 份食品、保健食品进行对照检测。

1.4 数据分析

采用Excel 2016软件进行数据统计，Origin 8.0软件（Origin Lab公司）作图。

2 结果与分析

2.1 表面活性剂对显色效果的影响

图2 吐温-20对试纸条显色效果的影响Fig. 2 Effect of Tween-20 concentration on the strip test’s sensitivity

本研究所建立的目视读取荧光半定量免疫层析检测法是以标记抗体依次结合4 条检测线为原理，判断药物对标记抗体的抑制程度，从而估算样品中的药物含量。由于需要尽可能使标记抗体和依次经过的检测线充分反应，所以层析速度比单检测线层析慢。表面活性剂可以增加标记抗体在层析体系中的分散性，从而增加层析速度。本研究首先选用单检测线免疫层析中常用的含0.5%吐温-20的复溶液，上样后8 min即可达到显色稳定。如图2所示，0.5%吐温-20的反应体系使层析速度过快，标记抗体不能和检测线上的包被抗原充分反应，导致多条检测线弱显色。而吐温-20含量过低（0.02%），标记抗体分散性较差，无法顺利层析。本研究结果发现在0.1%吐温-20的反应体系下，可获得最佳的显色效果，即该处理下条带显示清晰且条带数较少。

2.2 NC膜对显色效果的影响

图3 NC膜对试纸条显色效果的影响Fig. 3 Effect of NC membrane type on the strip test’s sensitivity

NC膜是影响免疫层析速度的另外一个因素，其孔径越大层析速度越快。本研究选用了3 种常用于免疫层析的膜，按孔径由大到小分别为Sartorius CN95、Sartorius CN140、Pall vivid 170。经测试，由于Pall vivid 170膜孔径过小，导致本研究所用的荧光纳米颗粒在该膜上发生层析阻滞。但Sartorius CN95由于流速过快，待测物显色效果不及在Sartorius CN140膜（图3）。本研究也通过调节表面活性剂吐温-20含量，以降低Sartorius CN95的流速，但是表面活性剂调节至0.02%时，在Sartorius CN95上同样出现了层析阻滞（结果未显示）。因此本研究采用Sartorius CN140作为试纸条NC膜。

2.3 抗体和抗原质量浓度对灵敏度的影响

研究发现上样的抗体（西布曲明抗体-荧光微球偶联物）质量浓度以及试纸条包埋的抗原质量浓度对检测灵敏度具有重要影响，优化免疫层析体系中抗体、抗原质量浓度是目视读取荧光半定量免疫层析检测法成功与否的关键。结果表明，检测线抗原质量浓度或荧光标记抗体量过低，将会导致无法获得清晰的检测线，而且还会导致定量试纸条稳定性差且保质期较短；相反它们质量浓度过高，虽然能获得清晰的检测线（强显色），但因为抗原或抗体的过量，也会影响竞争免疫检测方法的灵敏度。如表1所示，当荧光标记抗体量为2 μg和检测线抗原质量浓度为0.2 μg/mL时，能获得清晰的检测线，此时灵敏度最高，检出限低至0.05 μg/mL；而荧光标记抗体量和检测线抗原质量浓度均翻倍时（即抗体4 μg、抗原为0.4 μg/mL），尽管检测线上具有较强的显色，但是试纸条能达到的最低检测质量浓度却差了40 倍，只能达到2.0 μg/mL。本研究最终选取荧光标记抗体量为2 μg，检测线抗原质量浓度为0.2 μg/mL。

表1 抗体量和抗原质量浓度的正交分析Table 1 Orthogonal array design for the optimization of antibody and antigen concentration

2.4 层析时间的确定

图4 西布曲明荧光免疫层析动态荧光曲线Fig. 4 Dynamic fluorescent curves of sibutramine in fluorescent immunochromatography

免疫层析是一个动态反应的过程，因此确定合适的层析时间既关系到结果的准确也影响到检测时效。本研究使用纯水和0.05 μg/mL西布曲明溶液作为待测液，使用荧光扫描仪分别扫描检测1线和检测2线。如图4所示，免疫层析在10 min时达到平衡，因此10 min作为本方法的最佳层析时间。

2.5 检测方法评估

目视读取荧光免疫层析半定量检测方法的优点在于不需要使用复杂的分析仪器。本研究在方法评估时采用价格便宜且便携的LED荧光手电作为激发光源，在滤光片的辅助下目视读取荧光信号。滤光片的作用是滤除杂光，以得到清晰的条带。图5显示在暗室下采用手机（摄像头覆盖（540±25）nm滤光片）对荧光微球免疫层析试纸条进行拍照的结果。0.05 μg/mL西布曲明可将检测1线完全抑制消带，为试纸条西布曲明的最低检测限；在9.00 μg/mL时4 条检测线均不可见，为该方法检测西布曲明的最大质量浓度值。如果样品中西布曲明质量浓度过高（大于9.00 μg/mL），将会导致4 条检测线均不可见，需要再次稀释100 倍，使待测液中西布曲明的质量浓度在试纸条的检测范围内（0～9.00 μg/mL）。基于上述条件，计算得到实际样品的检出限为0.5 mg/kg，这与目前报道的西布曲明胶体金免疫层析方法的检出限相当[19,30]。

图5 西布曲明检出限和最大可检出质量浓度Fig. 5 Limit of detection and maximum detectable concentration of sibutramine

表2 与各减肥类药物的交叉反应率Table 2 Cross-reactivity of the method with various weight-reducing drugs

西布曲明属于一类结构相似功能相近的药物家族，常见的还包括N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明、苄基西布曲明和豪莫西布曲明。本研究依据BJS 201701《食品中西布曲明等化合物的测定》[29]，测试其中列出的违法添加减肥降脂类化合物的交叉反应。该方法对西布曲明家族药物均有交叉反应，和其他常见违法添加在保健食品中的减肥降脂类化合物无交叉反应（表2）。说明该方法对西布曲明类药物具有良好的广谱特异性。

2.6 实际样品检测结果

分别采用本研究新建立的目视读取荧光免疫层析法和BJS 201701《食品中西布曲明等化合物的测定》[29]LCMS/MS法对网络购买的50 份声称有减肥功效的食品、保健食品样品进行检测。结果显示，目视读取荧光半定量免疫层析法检测到西布曲明类药物的样品有10 份（检出率为20%），未检出的有40 份，而且其中有一个样品（样品6）非法添加的单去甲基西布曲明也能被检出，未观察到假阳性，该目视读取荧光免疫层析法与LC-MS/MS法的检测结果完全一致。表3显示，在被检出的10 个阳性样品中，所有的LC-MS/MS确证结果均能落在目视读取免疫层析法的半定量区间内，表明这2 种方法具有良好的正相关性。由此可见，目视读取免疫层析法能够满足西布曲明快速定性、半定量检测的需求，可为后续LC-MS/MS的确证工作提供参考依据。

表3 2 种方法检测食品中西布曲明含量（n=6）Table 3 Sibutramine contents in actual samples detected by the developed method and LC-MS/MS (n= 6)

3 结 论

本研究建立可基于肉眼直接读取结果的西布曲明半定量荧光微球竞争免疫层析检测方法。研究通过梯度降低竞争免疫层析反应体系中抗体的质量浓度，在单一试纸条中完成多个灵敏度不同的免疫反应，检测条带的显示数目随着目标待测物质量浓度的增加而逐渐减少，实现依靠普通荧光手电照射、肉眼直接读取结果的定性、半定量西布曲明检测方法。该方法通过试纸条上显色条带的数量即可对西布曲明进行半定量分析，方法简单、方便、成本低、灵敏度高，方法灵敏度与现有的西布曲明胶体金免疫层析方法相当，定性上未发现假阳性或假阴性，同时在定量结果具有一定的参考意义，能满足西布曲明快速筛查的需要。本研究提出的免疫层析半定量检测模式具有通用性，不仅适用于西布曲明检测，也能为其他药物的半定量检测提供新的研究思路。