基于低共熔溶剂的液液微萃取技术测定食用油中的新烟碱类杀虫剂

王素利，郭振福，庚丽丽

（河北北方学院 河北省农产品食品质量安全分析重点实验室，河北 张家口 075000）

新烟碱类杀虫剂是一类使用广泛的高效杀虫剂，目前有120多个国家登记[1]。其独特优势在于高效、选择性、植物内吸性，而且成功克服许多害虫对长期使用氨基甲酸酯、有机磷、拟除虫菊酯等杀虫剂产生的抗性，因此被广泛使用于粮食、蔬菜和水果作物以及种子处理剂。据报道，烟碱类杀虫剂对脊椎动物有较低急性毒性[2]。在哺乳动物实验模型中，暴露于这些化合物可以诱导生物效应[3]，减少蜂群[4]，吡虫啉可延缓小鼠胚胎[5]、鸡胚[6]的发育，其代谢产物对脊椎动物有毒性[7]，啶虫脒使鸟类精子密度明显降低[8]，噻虫啉对鸡胚有致畸作用[9]，可能影响人类健康[10-12]。因此，不同国家制定了不同农产品，包括蔬菜和谷物中新烟碱类杀虫剂的最大残留限量。

食用油营养价值丰富，在日常生活中起着不可或缺的作用[13]。它能提供人体必需的脂肪酸，是脂溶性维生素的载体，能够为人体提供需要的能量，维持正常体温等作用[14-15]。大豆、油菜、向日葵、亚麻等产油作物使用大量杀虫剂，植物油通过提取加工和浸着得到，农药残留仍可能发生在最终的食用油中，给人们健康带来安全隐患。因此加强食用油的质量安全控制具有重要的意义[16]。欧盟、食品法典委员会、世界卫生组织制定了用于产油作物油籽中一些烟碱类的最大残留限量为0.02～0.05 mg/kg[17]，GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》中也制定了一些烟碱类在油籽中的最大残留限量为0.02～0.5 mg/kg。

由于食用油基质比较复杂，共提杂质多，必须经过净化才能通过仪器检测。液液萃取后经过EMR-lipid柱净化[18]、基质固相分散[19]、QuEChERS[20]、分散固相萃取净化[21]、冷冻法和分散固相净化联用[22]，这些方法费时，不能一步完成。目前，前处理方法正向着简单、省时、小型化、减少有机溶剂的方向发展。分散液液微萃取是一种简单快速的液相萃取方法[23-24]。传统分散液液使用的提取溶剂密度较大、难溶于水，而且大部分是一些含氯溶剂，毒性较高、容易挥发，急需绿色溶剂替代[25]。低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）具有独特优良的性质，同时生产成本低廉、合成路线简单、可生物降解、无毒环保等优点，被认为是一种环境友好的绿色溶剂，可以作为溶剂替代分散液液微萃取技术中的传统有机溶剂，在分散液相微萃取技术中具有潜在应用前景[26-28]。DES作为萃取溶剂在分散液液微萃取技术中用于食用油中的羟丙基苯丙类、酚类、三嗪类除草剂、双酚A、木脂素的测定[29-33]，用于烟碱类农药检测鲜见报道。

本实验利用氯化胆碱合成的绿色DES作为液相微萃取技术中的萃取剂，利用超声波辅助分散，建立高效液相色谱测定食用油中4 种新烟碱类杀虫剂的检测方法，并且测定实际样品中的4 种新烟碱类农药，以期为油样品中提取有机污染物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙二醇、甘油、正己烷（均为分析纯） 北京化学试剂公司；氯化胆碱（纯度99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 德国Merck公司；噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉标准品（纯度均大于98%） 中国标准物质有限公司。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱系统（配有二极管阵列检测器）美国安捷伦公司；TDL-50B低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；WD-9415E型超声波清洗器 北京市六一仪器厂；Nicolet IS5傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱测定条件

二极管阵列检测器；波长254 nm；流速1 mL/min；Zorbax extend-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相分别为甲醇（A）和水（B）；梯度洗脱：0 min，10% A，90% B；10 min，40% A，60% B；15 min，80% A，20%B；20 min，10% A，90% B；进样量20 μL。

1.3.2 DES的合成

以氯化胆碱作为氢键受体，乙二醇、甘油、尿素为氢键给体，按照物质的量比1∶2混合置于10 mL玻璃离心管中，在涡旋仪中涡旋混合直到形成均匀清澈透明的液体。即氯化胆碱-乙二醇、氯化胆碱-甘油、氯化胆碱-尿素DES。同时合成了氯化胆碱-乙二醇物质的量比1∶1、1∶3、1∶4的DES，并且保存在避光处备用。

1.3.3 超声辅助分散液液微萃取操作过程

分别称取10.0 mg标准物质于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成1 000 mg/L的单标，然后分别量取1 mL单标于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容为100 mg/L的混合标准贮备液，单标和储备液均在-20 ℃保存。将储备液用甲醇稀释至适当质量浓度作为工作液，将混合标准储备液稀释到10 mg/L作为工作液用于样品前处理。

1 mL食用油中添加一定质量浓度的混合烟碱类农药标准溶液，涡旋混合均匀，然后用2 mL正己烷稀释，加入50 μL的氯化胆碱-乙二醇（物质的量比1∶2）配成的DES，超声分散5 min，形成浑浊液，3 000 r/min离心10 min，DES相沉积到试管底部，用注射器除去上层液体后，再向剩余物中加入2 mL正己烷，超声分散5 min，3 000 r/min离心10 min，除去上层的正己烷洗涤液，残余物用甲醇定容至1 mL，吸入内衬管中，进行液相色谱分析。

1.3.4 超声辅助分散液液微萃取条件优化

为了优化萃取条件，在1 mL菜籽油中添加烟碱类农药混合标样，使添加质量浓度为50 μg/L。对影响萃取效率的影响因素进行优化，如食用油与正己烷比例、DES的种类和体积、萃取时间、离心时间等，每次实验均在改变一个参数其他参数保持不变的情况下进行，每个实验重复3 次。

1.3.5 方法有效性和确证

应用优化的超声辅助分散液液微萃取方法进行线性、准确度和精密度测定。分别取一定量标准混合储备液梯度稀释为0.01、0.05、0.1、0.02、0.5 mg/L混合标准溶液进行线性测定。在菜籽油中添加一定量的工作液使添加质量浓度为50 μg/L，重复5 次，进行回收率和精密度（相对标准偏差（relative standard deviation，RSD））实验。

从本地超市购买的葵花籽油、大豆油、胡麻油实际样品用超声辅助分散液液微萃取方法测定。为考察基质效应对该方法的影响，分别在3 种食用油中进行质量浓度20、50、100 μg/L和500 μg/L的添加回收率实验，每个质量浓度重复3 次。

2 结果与分析

2.1 合成DES的傅里叶变换红外光谱表征

图1 氯化胆碱（A）、乙二醇（B）、氯化胆碱与乙二醇（1∶2）（C）的红外光谱图Fig. 1 FT-IR spectra of choline chloride (A), ethylene glycol (B) and DES of choline chloride and ethylene glycol at 1:2 ratio (C)

DES的合成主要作用力是分子间形成氢键[27-28]，如图1所示，纯化胆碱氯、乙二醇在3 279、3 393 cm-1处的特征峰分别由O—H振动引起。在DES中乙二醇特征峰3 393 cm-1向3 377 cm-1移动，可能是由于氧原子上电子云向氢键的转移。因此O—H振动的移动表明氢键的存在和DES的形成。

2.2 超声辅助分散液液微萃取条件优化

2.2.1 油与正己烷比例

考察实验样品中食用油、正己烷的不同比例对分析物萃取效率的影响。按照1 mL菜籽油用正己烷1 mL或者2 mL稀释，稀释比例为1∶1和1∶2。图2显示氯化胆碱-乙二醇或氯化胆碱-甘油两种DES萃取剂，2 mL正己烷稀释的萃取效率均高于1 mL正己烷，表明菜籽油被2 倍体积正己烷稀释后，萃取效果较好。

2.2.2 萃取剂DES类型的选择

DES萃取剂的选择对萃取效率影响非常重要[31]。以乙二醇、甘油、尿素作为氢键给体，氯化胆碱作为氢键受体，均以物质的量比2∶1混合制备的DES对菜籽油中的烟碱类杀虫剂萃取。如图3A所示，其他条件相同下，乙二醇与氯化胆碱形成的DES比甘油、尿素与氯化胆碱形成的DES萃取效率高。原因可能是由于甘油和氯化胆碱形成的DES的黏度高于乙二醇，阻止了目标分析物的传质作用[34]。尿素形成的DES极性比乙二醇形成的小。从实验结果看出乙二醇与氯化胆碱形成的萃取剂DES萃取效率最高，是最适萃取剂。

图3 DES种类（A）和氯化胆碱-乙二醇比例（B）对萃取效率的影响Fig. 3 Effect of DES type (A) and choline chloride to ethylene glycol ratio (B) on the extraction efficiency

然后对氯化胆碱和乙二醇不同物质的量比形成的DES对萃取率的影响进行研究。如图3B所示，当氯化胆碱-乙二醇物质的量比1∶2时回收率最大，由于在1∶1时黏度较大，不利于分析物的传质，当比例再增大，极性太强，对极性较弱的吡虫啉和噻虫啉萃取率降低，因此，选择氯化胆碱-乙二醇物质的量比1∶2的DES作为萃取剂，进行下一步实验。

2.2.3 DES体积对萃取效率的影响

图4 DES体积对萃取效率的影响Fig. 4 Effect of DES volume on the extraction efficiency

由上确定氯化胆碱和乙二醇1∶2的DES作为萃取剂，DES的体积对萃取效率具有一定的影响。本研究分别对25、50、75、100 μL和130 μL体积萃取效率进行实验。由图4可以看出，当DES体积大于50 μL时回收率逐渐减小，可能是体积增大稀释所致。因此，在DES的体积为50 μL时萃取效率最高。

2.2.4 超声萃取时间和离心时间的优化

图5 超声萃取时间对萃取效率的影响Fig. 5 Effect of ultrasonication time on the extraction efficiency

如图5所示，随着时间的延长，萃取效率不断上升，当时间超过8 min，响应值不再上升，8 min萃取效率达到最高，说明在此时间内已达到饱和。离心的目的是使DES相与样品进行有效分离，本实验在1～20 min内转速4 000 r/min条件下离心。结果表明，当离心时间为10 min时，回收率达到最高，时间延迟后，峰面积并未明显变化，因此，离心时间选择为10 min。

2.3 方法有效性评价

在已优化条件下对其线性、回收率、重复性、准确度、检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）进行测定，所有实验在菜籽油中进行，如表1所示。在0.01～0.5 mg/L内线性良好，相关系数大于0.99。添加质量浓度为50 μg/L时，重复5 次，回收率和RSD分别为81.9%～98.0%和5.5%～8.3%，LOD和LOQ以标准曲线最小质量浓度3 倍信噪比和10 倍信噪比计算，分别为3.2～5.3 μg/L和10.8～17.7 μg/L。

表1 4 种烟碱类杀虫剂的线性方程、相关系数、LOD、LOQ、回收率和RSDTable 1 Linear calibration equations, correlation coefficients (R2),LODs and LOQs of four neonicotinoid insecticides

2.4 样品测定和方法验证

用建立的超声辅助分散液液微萃取方法测定市购样品中的4 种烟碱类农药，均未检出。分别对市购样品进行添加回收实验，结果如表2所示，回收率在83.4%～100.8%之间，RSD在2.1%～8.2%之间。 结果表明，基质对萃取效果无显著影响，该方法对测定实际食用油中新烟碱类杀虫剂方法具有有效性和可行性，大豆油添加样品色谱图如图6所示。

表2 4 种新烟碱类杀虫剂应用超声辅助分散液液微萃取在大豆油、葵花籽油和胡麻油中的添加回收率和RSD（n=3）Table 2 Recoveries and RSDs of new neonicotinoid insecticides spiked to soybean oil, sunflower seed oil and linseed oil at different concentrations (n= 3)

图6 大豆油空白（a）和添加4 种烟碱类杀虫剂样品（b）色谱图Fig. 6 HPLC chromatograms of blank soybean oil (a) and sample spiked with four neonicotinoid insecticides (b)

2.5 超声辅助分散液液微萃取与其他方法比较结果

表3 超声辅助分散液液微萃取与其他方法比较Table 3 Comparison of the proposed UA-DES-LLM method with other methods for the determination of neonicotinoid insecticides

为了评价本实验所建立的方法超声辅助分散液液微萃取的有效性，与其他发表的检测油样品中目标分析物的方法进行比较，结果如表3所示。目前常用于植物油样品中烟碱类农药前处理方法主要是QuEChERS或者其改进方法，通常使用固相吸附剂PSA、C18、GCB等去除脂肪和杂质，改进方法使用Z-Sep、EMR-Lipid等增强去除油脂性能[36]，为了更好地去除油脂附加冷冻技术[36]。检测大多使用液相色谱-质谱联用技术，能够进行多残留检测，由于单独使用液相色谱LOD达不到要求[38]。本方法超声辅助分散液液微萃取使用氯化胆碱和乙二醇合成的DES作为萃取剂，减少有毒有害有机溶剂使用。同时，DES较好的色谱行为节省了净化过程，而且能够用于液相色谱的检测，方法更简单，提取时间更短，得到的检出限与公布方法的LOD相似或者更低。因此，本方法为植物油中烟碱类的检测提供了另一种选择。

3 结 论

本研究建立一种简单、快速测定食用油中4 种新烟碱类杀虫剂的超声辅助分散液液微萃取萃取方法。对合成不同类型DES作为萃取剂的萃取效率进行研究。结果表明，由氯化胆碱和乙二醇物质的量比为1∶2形成的DES具有最佳的萃取性能。对影响萃取效率的主要因素进行优化，在最佳优化条件下，该方法具有良好的线性、满意的回收率、重复性和较低的LOD，能够满足农药残留分析的要求。并且成功地应用于实际食用植物油样品中4 种新烟碱类杀虫剂的检测，基质对萃取效果无显著影响，该方法对测定实际食用油中新烟碱类杀虫剂方法具有有效性和可行性。因此，超声辅助分散液液微萃取具有成本低、简单、快速、灵敏度高的特点，有望成为从油样品中提取有机污染物潜在的液相微萃取技术。