产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用

甄红敏，华晓晗，马俊文，温永平,3，李延啸,*，闫巧娟,*，江正强

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中国农业大学工学院，北京 100083；3.蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司，北京 100101）

β-甘露聚糖酶是一种能够特异性水解甘露聚糖主链中β-1,4-糖苷键的水解酶，产物主要为不同聚合度的甘露寡糖[1]。β-甘露聚糖酶在细菌、放线菌、真菌、植物和一些低等动物中广泛存在，微生物来源的β-甘露聚糖酶产量高、成本低、提取简单，因而最具应用潜力[2]。根据氨基酸序列相似性，β-甘露聚糖酶可分为4 个糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）家族，即GH5、GH26、GH113和GH134家族。大部分动植物和真菌来源的β-甘露聚糖酶和部分细菌β-甘露聚糖酶属于GH5家族，多数细菌β-甘露聚糖酶和少数真菌β-甘露聚糖酶则属于GH26家族[3]。GH113家族的β-甘露聚糖酶主要来源于脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillussp.）等少数细菌[4]；GH134家族的β-甘露聚糖酶则主要来源于构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和微孢根霉（Rhizopus microsporus）等[5]。作为一种重要的糖苷水解酶，β-甘露聚糖酶的应用范围已涵盖食品、饲料、造纸等多个行业[6]。

生产甘露寡糖是β-甘露聚糖酶的一个重要应用。甘露寡糖的制备方法主要包括物理降解、化学降解以及酶法降解[7-9]。与物理和化学法相比，酶法降解条件温和、过程可控、成本低廉、环境友好，是制备甘露寡糖最常用的方法。目前，甘露寡糖已被证实具有促进益生菌增殖、降低血脂、控制血糖等功能活性[10]。实现β-甘露聚糖酶的高效表达，是应用于甘露寡糖生产的前提和基础。虽然一些β-甘露聚糖酶已在毕赤酵母（Pichia pastoris）中进行高效表达，但它们大多数属于GH5家族，如米黑根毛霉（R. miehei）来源的RmMan5A、mRmMan5A和毛壳菌（Chaetomiumsp.）来源的CsMan5A等[11-13]，仅有少数GH26家族β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中实现了高效表达，如芽孢杆菌（Bacillussp.）来源的mannS和Bman26/MEIR[14-15]。这些GH26家族的β-甘露聚糖酶难以满足不同大规模应用的需要。此外，不同家族β-甘露聚糖酶的水解特性明显不同，如毛壳菌CQ31来源的GH5家族β-甘露聚糖酶CsMan5A水解魔芋粉等甘露聚糖主要产生聚合度2～4的寡糖和一些甘露糖[11]；牛瘤胃宏基因组来源的GH26家族β-甘露聚糖酶CrMan26的最佳水解底物为角豆胶等半乳甘露聚糖[16]。不同来源β-甘露聚糖酶水解魔芋粉所得产物也有所不同，如Talaromyces cellulolyticus来源的β-甘露聚糖酶水解魔芋粉可获得聚合度3～7的甘露寡糖，单糖组分含量较少[17]；而枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）来源的β-甘露聚糖酶水解魔芋粉，甘露寡糖得率为57.8%，且会产生较多的甘露糖和葡萄糖[18]。因此，开发更多适用于甘露寡糖生产的甘露聚糖酶，并实现其高效生产，对甘露寡糖的生产具有重要意义。

产黄青霉（Penicillium chrysogenum）是一种重要的工业用真菌，主要用于生产青霉素和多种有机酸，同时能够分泌木聚糖酶、淀粉酶等多种糖苷水解酶[19-20]。本研究从产黄青霉基因组中发掘出一个假想蛋白（GenBank No.CAP97963.1），预测为GH26家族β-甘露聚糖酶（PcMan26A），将其基因导入毕赤酵母GS115中高效表达，研究该酶酶学性质，并用于水解魔芋粉制备魔芋甘露寡糖，旨在为利用魔芋粉制备魔芋甘露寡糖提供更多选择。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毕赤酵母GS115 北京全式金生物技术有限公司；载体pPIC9K 美国Invitrogen公司；甘露寡糖（甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖） 爱尔兰Megazyme公司；槐豆胶、瓜尔胶 美国Sigma-Aldrich公司；魔芋粉（葡甘露聚糖含量≥80%，甘露糖/葡萄糖=1.62） 湖北强森魔芋科技有限公司。

1.2 仪器与设备

1260 Infinity II system高效液相色谱仪、1260 Infinity system凝胶排阻色谱仪、G7162A型示差折光检测器美国Agilent公司；ÄKTA蛋白纯化系统 美国GE Healthcare公司；5 L发酵罐 上海国强生化工程装备有限公司。

1.3 方法

1.3.1β-甘露聚糖酶基因（PcMan26A）的克隆及表达

根据NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）信息，发掘出一段预测为GH26家族β-甘露聚糖酶基因（GenBank Accession No.CAP97963.1）。根据该基因序列设计特异性扩增引物PcMan26AF（5′-GATCCTCCGGA ATTCGCTGGTTTGTCTTACGATAATATTGATAA-3′）和PcMan26AR（5′-GATACAAGCGGCCGCTTAATTCT TTTTCTTATCCTCAATAGTAACAAC-3′），以产黄青霉的cDNA为模板扩增该基因（PcMan26A）。聚合酶链式反应扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸8 min。扩增产物经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后与载体pPIC9K连接，得到重组质粒pPIC9K-PcMan26A，利用限制性内切酶SalI线性化后电转化毕赤酵母感受态细胞。β-甘露聚糖酶的分泌表达及高拷贝转化子的筛选参考Li Yanxiao等[12]的方法。高拷贝转化子筛选时，用2～3 mL无菌水重悬MD培养基上的重组菌，分别涂布在含有不同质量浓度（1.0～8.0 mg/mL）遗传霉素G418的YPD-G418筛选培养基上，在30 ℃倒置培养3 d。挑取筛选培养基上的单菌落接种于5 mL甘油发酵（buffered minimal glycerol-complex medium，BMGY）培养基，在30 ℃、200 r/min下振荡培养至OD600nm达2～6，3 000×g离心5 min收集细胞，重悬于10 mL诱导表达（buffered methanol-complex medium，BMMY）培养基进行诱导表达，每24 h加甲醇（终体积分数0.5%），诱导3 d后测定酶活力。

1.3.2 高密度发酵产PcMan26A

利用5 L发酵罐进行毕赤酵母高密度发酵，方法参考文献[21]。在200 mL BMGY培养基中接种重组毕赤酵母，于30 ℃、200 r/min培养至OD600nm达到10.0，得到种子液；发酵罐内1.5 L BSM培养基灭菌后，用氨水调节pH值至4.0，温度30 ℃，转速600 r/min，通气量1 vvm；随后将种子液接种于发酵罐中，发酵18～24 h，罐内甘油耗尽后，继续流加甘油4～5 h；待发酵液OD600nm达180～220，饥饿30 min；随后流加100%甲醇诱导培养基，并调节pH值至6.0、转速800 r/min、通气量1.5 vvm，通过控制流加速度和空气流量使罐内溶氧保持在20%以上，继续发酵168 h，并每隔12 h取样，分析PcMan26A酶活力、蛋白含量和菌体湿质量。

1.3.3PcMan26A的纯化

发酵液10 000×g离心10 min，上清液4 ℃透析12 h，透析液为20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）。利用Q-Sepharose阴离子交换层析纯化PcMan26A，用Tris-HCl缓冲液（20 mmol/L，pH 8.0）平衡Q-Sepharose柱，上样后用0～500 mmol/L NaCl溶液（20 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0）线性洗脱（12 个柱体积），流速为1.0 mL/min，整个过程在ÄKTA纯化系统上进行。收集有酶活力的组分4 ℃透析12 h，透析液为20 mmol/L醋酸缓冲液（pH 6.0）。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯酶和Endo H处理后的酶[22]。

对PcMan26A进行酶谱分析时，在分离胶中添加1 mg/mL槐豆胶，电泳结束后用25%（V/V）异丙醇溶液浸泡3 次（15 min/次），用50 mmol/L醋酸缓冲液（pH 6.0）漂洗电泳胶3 次（10 min/次），随后将电泳胶浸泡于50 mmol/L醋酸缓冲液（pH 6.0）置于40 ℃反应30 min，并用0.5 g/L刚果红溶液染色20 min，再用1 mol/L NaCl溶液脱色20 min，最后用0.5%（V/V）乙酸溶液定色。

1.3.4PcMan26A酶活力和蛋白浓度的测定

以甘露糖为标准，用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定PcMan26A酶活力[23]。将900 μL槐豆胶溶液（5 mg/mL，50 mmol/L醋酸缓冲液，pH 6.0）与100 μL稀释后的酶液混合均匀后，50 ℃反应10 min，加入1 mL DNS试剂沸水浴15 min显色，随后加入1 mL 40%酒石酸钾钠溶液并迅速冷却，在540 nm波长处测定吸光度。酶活力定义：每分钟产生1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。以牛血清蛋白为标准，参照Lowry等[24]的方法测定蛋白含量。

1.3.5PcMan26A的酶学性质

测定最适pH值时，用50 mmol/L不同pH值的缓冲液按照标准方法测定酶活力，以最高酶活力为100%，计算各pH值下的相对酶活力。缓冲体系为：柠檬酸缓冲液（pH 3.0～6.0）、醋酸缓冲液（pH 4.0～6.0）、MES缓冲液（pH 5.5～6.5）、磷酸缓冲液（pH 6.0～8.0）、HEPS缓冲液（pH 6.5～8.0）和CHES缓冲液（pH 8.0～10.0）。测定pH值稳定性时，用上述缓冲液稀释酶液，并在30 ℃保温30 min，按标准方法测定酶活力，以未经处理的酶液为100%，计算各pH值下的残余酶活力。

测定最适温度时，在30～70 ℃按照标准方法测定酶活力，以最高酶活力为100%，计算各温度下的相对酶活力。测定温度稳定性时，将适当稀释后的酶液于30～70 ℃保温30 min，按照标准方法测定酶活力，以未经处理的酶液为100%，计算各温度下的残余酶活力。

1.3.6PcMan26A的底物特异性和水解特性

以槐豆胶、瓜尔胶和魔芋粉等为底物（5 mg/mL），按照标准方法测定酶活力，计算该酶对不同底物的比活力。

测定水解特性时，用醋酸缓冲液（50 mmol/L，pH 6.0）分别配制10 mg/mL的甘露聚糖（魔芋粉、槐豆胶和瓜尔胶）和甘露寡糖（甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖和甘露五糖），添加5 U/mL的PcMan26A 40 ℃水解12 h，在不同时间点取样。用薄层层析检测产物组成，标准品为甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖和甘露五糖。

1.3.7PcMan26A水解魔芋粉

在高速搅拌下，将100.0 g魔芋粉溶于500 mL醋酸缓冲液（50 mmol/L，pH 6.0），置于40 ℃预热30 min，加入PcMan26A（加酶量200 U/mL），在40 ℃、600 r/min下水解12 h，之后沸水浴灭酶20 min。10 000×g离心15 min，取上清液浓缩冻干后即为魔芋甘露寡糖。

魔芋甘露寡糖的组成用高效液相色谱-示差折光检测器（high performance liquid chromatography-differential refractive index detector，HPLC-RID）分析测定。样品过0.22 μm滤膜上样，色谱柱为Shodex Sugar KS-802（7.8 mm×300 mm），柱温为65 ℃，流动相为纯水，流速0.8 mL/min，检测器温度35 ℃，标准品为甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。

2 结果与分析

2.1 PcMan26A的基因克隆

产黄青霉来源的PcMan26A全长1 017 bp，编码338 个氨基酸，属于GH26家族。经SignalP 4.1分析，N端有一个信号肽序列，含有18 个氨基酸。氨基酸序列同源比对分析表明（图1），该酶与黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88来源的β-甘露聚糖酶（GenBank No.A2R6F5.1）相似性最高，为67.8%；其次分别为Thermothelomyces thermophilusATCC 42464（GenBank No.G2Q4H7.1）、构巢曲霉（A. nidulans）FGSC A4（GenBank No.Q5AWB7.1）、海洋红嗜热盐菌（Rhodothermus marinus）DSM 4252（GenBank No.P49425.3）和Piromycessp.（GenBank No.P55296.1）来源的β-甘露聚糖酶，其相似性分别为43.2%、41.8%、40.5%和31.0%。通过氨基酸序列比对预测，该酶中第189位和281位的谷氨酸残基（Glu189和Glu281）分别为该酶亲核试剂和广义酸碱。

图1 产黄青霉PcMan26A与其他同家族β-甘露聚糖酶多重序列比对Fig. 1 Amino acid sequence similarity between PcMan26A and other β-mannanases from the family GH 26

2.2 PcMan26A的高效表达及纯化

通过高拷贝转化子筛选，1 株高产重组菌株的摇瓶发酵酶活力为261.8 U/mL。将该重组菌株进行高密度发酵，168 h后菌体湿质量达500 g/L，酶活力和蛋白质量浓度分别达到25 200 U/mL和10.1 mg/mL（图2A）。甲醇诱导开始后，发酵液中首先出现分子质量60 kDa的蛋白条带，发酵48 h后出现47 kDa的蛋白条带；随着诱导时间延长，2 条蛋白条带均逐渐变粗（图2B）。

图2 毕赤酵母高密度发酵产PcMan26A历程Fig. 2 Expression of PcMan26A in P. pastoris GS115 during high cell density fermentation

通过阴离子交换层析一步纯化得到电泳级纯酶（PcMan26A），回收率为80.7%，纯化倍数为1.2 倍。PcMan26A在电泳胶上呈2 条不同的条带，其分子质量分别为60 kDa和47 kDa，均有明显拖尾现象；酶谱分析表明，2 条蛋白均有β-甘露聚糖酶活性（图3），这表明该酶在毕赤酵母中表达可能发生了不同程度的糖基化。去糖基化酶Endo H处理后，PcMan26A在电泳胶上仍然呈2 条带，但分子质量分别降低至50 kDa和39 kDa，没有出现拖尾现象，表明毕赤酵母表达的PcMan26A确实发生了糖基化。

图3 PcMan26A的纯化图Fig. 3 SDS-PAGE profiles of crude and purified PcMan26A

2.3 PcMan26A的酶学性质

如图4所示，该酶的最适pH值为6.0，pH 4.0～8.0处理30 min仍保留80%以上的酶活力；该酶的最适温度为50 ℃，在45 ℃下处理30 min仍保留90%以上的酶活力。

图4 PcMan26A的最适pH值（A）、pH值稳定性（B）、最适温度（C）和温度稳定性（D）Fig. 4 Optimal pH (A), pH stability (B), optimal temperature (C), and thermostability (D) of PcMan26A

2.4 PcMan26A的底物特异性和水解特性

图5 PcMan26A的水解特性Fig. 5 TLC analysis of mannans and manno-oligosaccharides hydrolyzed by PcMan26A

PcMan26A对槐豆胶的比活力为2 967.7 U/mg，对魔芋粉和瓜尔胶的比活力分别为3 581.0 U/mg和1 442.1 U/mg。水解特性分析表明（图5），该酶水解槐豆胶时主要产生甘露二糖、甘露三糖和一些聚合度大于3的甘露寡糖；水解魔芋粉时主要产生聚合度大于4的甘露寡糖；水解瓜尔胶时主要产生聚合度大于5的甘露寡糖。此外，该酶的最小水解底物为甘露五糖，主要产生甘露四糖和少量的甘露糖。

2.5 魔芋甘露聚糖的制备

利用PcMan26A在最适条件下（200 g/L魔芋粉，加酶量200 U/mL）水解魔芋粉12 h后，魔芋粉中葡甘露聚糖的水解率为91.8%，魔芋甘露寡糖总得率为86.2%。经HPLC分析，产物主要为聚合度大于4的甘露寡糖（图6）。此外，甘露六糖保留时间右侧寡糖组分的峰面积超过总峰面积的50%，符合我国颁布的“新食品原料”（2013年第10号公告）目录[25]中的相关规定。

图6 魔芋甘露寡糖的组分分析Fig. 6 HPLC profile showing the composition of konjac manno-oligosaccharides

3 讨 论

本研究从产黄青霉基因组中发掘了一个GH26家族PcMan26A，该酶与黑曲霉CBS 513.88来源的β-甘露聚糖酶同源性最高（67.8%），与其他GH26家族β-甘露聚糖酶同源性均在45%以下（图1），表明该酶为一个新型GH26家族β-甘露聚糖酶。经高密度发酵，该酶的毕赤酵母发酵液蛋白质量浓度可达10.1 mg/mL（图2），显著高于芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等来源的β-甘露聚糖酶，它们在毕赤酵母中的表达水平仅为2.2～6.6 mg/mL[15,26]。虽然该酶产酶水平低于一些GH5家族β-甘露聚糖酶，如毛壳菌CQ31来源的CsMan5A（50 030 U/mL）[11]和米黑根毛霉CAU432来源的RmMan5A（85 200 U/mL）[12]，但其产酶水平明显高于大多数GH26家族β-甘露聚糖酶，如黑曲霉CBS 513.88来源的Man26A（5 069 U/mL）[27]和枯草芽孢杆菌TBS2来源的ReTMan26（5 435 U/mL）[28]。

该酶在电泳胶上呈47 kDa和60 kDa两条蛋白条带，酶谱分析表明它们均具有β-甘露聚糖酶活性（图3）。通过NetNGlyc和NetOGlyc分析，PcMan26A氨基酸序列中有3 个N-糖基化位点（Asn147-Ser148-Thr149、Asn154-Gly155-Thr156和Asn269-Val270-Thr271）和4 个O-糖基化位点（Ser13、Thr29、Ser148和Thr149）。利用Endo H处理后，2 个条带分别降低至39 kDa和50 kDa，其中39 kDa的条带与该酶的预测分子质量（38 kDa）一致，而另一个条带的分子质量（50 kDa）则高于预测分子质量。这可能是由于该酶在毕赤酵母中同时发生了N-糖基化和O-糖基化，Endo H只能去除N-糖基化，而无法去除O-糖基化。

PcMan26A的最适pH值为6.0，在酸性条件下具有较高催化活性（图4），这与大部分真菌来源β-甘露聚糖酶类似，如米曲霉（A. oryzae）RIB40、嗜热毁丝菌（Myceliophthora thermophila）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）MGQ2来源的β-甘露聚糖酶[29-31]。其最适pH值明显低于一些细菌来源β-甘露聚糖酶，如肠杆菌（Enterobactersp.）N18（pH 7.5）、嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）BCRC 19214（pH 8.0）和芽孢杆菌N16-5（pH 9.5）来源的β-甘露聚糖酶[32-34]。该酶的最适温度为50 ℃，与大部分微生物β-甘露聚糖酶最适温度（40～60 ℃）相似[14,35]，但明显低于一些嗜热微生物来源β-甘露聚糖酶，如费氏新萨托菌（Neosartorya fischeri）P1的rMan5P1（80 ℃）[36]、来源于嗜热裂孢菌BCRC 19214的Tfu-man（80 ℃）[32]和来源于Talaromyces leycettanusJCM12802的TlMan5A（90 ℃）[37]。

不同家族β-甘露聚糖酶的最小水解底物有所不同。大部分GH5家族β-甘露聚糖酶的最小水解底物为甘露三糖，多数GH26家族β-甘露聚糖酶的最小水解底物为甘露四糖[38]。枯草芽孢杆菌来源的GH26家族β-甘露聚糖酶Bman26/MEIR水解甘露四糖主要产生甘露二糖以及少量甘露糖和甘露三糖[14]；Clostridium thermocellum来源的GH26家族β-甘露聚糖酶则具有糖苷酶活性，其能将甘露二糖水解为甘露糖[39]。与大部分GH26家族β-甘露聚糖酶不同，PcMan26A的最小水解底物为甘露五糖，能将甘露五糖水解为甘露糖和甘露四糖，不产生甘露二糖和甘露三糖（图5），这有利于水解时甘露寡糖组分的积累。利用该酶水解槐豆胶、魔芋粉、瓜尔胶等底物时，产物主要为高聚合度寡糖，几乎不产生甘露糖，表明该酶适用于甘露寡糖生产。利用PcMan26A水解200 g/L魔芋粉所得魔芋甘露寡糖中，主要为聚合度大于4的寡糖组分（图6）。与低聚合度的甘露寡糖相比，高聚合度的甘露寡糖在人体肠道内发酵速度更慢，能够顺利到达人体远端结肠，促进远端结肠中有益菌生长增殖[40]。因此，将上述魔芋甘露寡糖与低聚木糖、低聚果糖等低聚合度寡糖复配，对整个结肠（近端和远端）中有益菌生长均可起到促进作用。

4 结 论

本研究将一个来源于产黄青霉GH26家族的PcMan26A在毕赤酵母中高效表达，经高密度发酵产酶水平达25 200 U/mL。该酶对魔芋粉具有最高的比活力，水解甘露聚糖主要产生一些高聚合度（＞4）甘露寡糖，在甘露寡糖酶法制备中具有应用潜力。利用PcMan26A水解魔芋粉成功制备得到魔芋甘露寡糖。这为魔芋甘露寡糖的酶法制备提供了更多选择。