相对分子质量对木聚糖结晶能力的影响

金旭宸，项舟洋

(华南理工大学 制浆造纸工程国家重点实验室,广东 广州 510640)

木聚糖是阔叶木及草类植物细胞壁中半纤维素的主要成分，拥有由β-1,4-糖苷键连接的D-吡喃木糖单元构成的主链结构。根据植物来源的不同，木糖单元上C2、C3或C2/C3位的羟基往往被α-D-吡喃葡萄糖醛酸、4-O-甲基-α-D-吡喃葡萄糖醛酸及α-L-呋喃阿拉伯糖所取代。在植物细胞壁中，大多数的木聚糖被部分乙酰化[1-3]。由于乙酰基及其它支链的影响，原生木聚糖为无定形的聚合物，但是脱乙酰基及低支链度的木聚糖可以和溶剂分子例如水、DMSO等形成结晶结构[4-5]，最常见的为木聚糖水合晶。木聚糖水合晶中木聚糖分子构型呈左手三重螺旋结构，水分子填充在木聚糖分子构型的空隙中，起到稳定晶格的关键作用；木聚糖水合晶一旦完全干燥，排除掉所有水分子，结晶结构就会消失[6-8]。芬兰的Kontturi课题组以及法国的Nishiyama课题组联合发现：在DMSO中充分分散的碱提脱乙酰木聚糖通过加热诱导能够与DMSO分子发生结晶，说明脱乙酰木聚糖不仅可以和水分子，还可以和其它溶剂分子形成结晶结构[5]。通过化学衍生化合成的完全乙酰化的木聚糖不需要溶剂分子，可以自身形成结晶结构，乙酰基占据了水合晶中水分子的位置，因而不需要水分子的稳定作用[9]。碱处理能够脱除木聚糖上的乙酰基，且分离得率较高，是木聚糖常用的分离方法。碱提木聚糖在很多情况下以水合晶的形式存在，特别是高浓度碱提取或低浓度酒精沉淀出来的支链度较低的木聚糖[4]。水合晶的存在会降低木聚糖的溶解性、分散性及黏度[10]，阻碍木聚糖水铸膜的成膜[4]，但是有利于木聚糖对油水混合液的乳化及对无机功能粒子例如碳纳米管(CNT)的分散[11]。前人的研究已经发现天然分离的脱乙酰木聚糖的结晶受其支链的抑制，支链糖基和木糖物质的量比(支链度)为1∶13～1∶40的阔叶木木聚糖样品中，支链度越高，X射线衍射(XRD)观察到的结晶衍射环越不明显[8]。黑麦木聚糖支链度大于0.5时为无定形，小于0.5时XRD分析能发现明显的木聚糖水合晶特征峰[10]。本课题组最新的研究也发现，蔗渣木聚糖支链度大于0.15时为无定形，小于0.15时具有木聚糖水合晶的XRD特征峰。可以看出，木聚糖的水合结晶能力与其化学结构高度关联，而鲜有报道从相对分子质量的角度来分析其对木聚糖结晶能力的影响。已有文献表明减少聚合物分子链的长度能够增加分子链的自由度并降低其聚集形成规整结构的概率[12]，因此推测，通过调控脱乙酰木聚糖的相对分子质量也可以影响木聚糖结晶能力。本研究通过内切木聚糖酶处理的方法，获得具有不同相对分子质量的脱乙酰木聚糖，探究相对分子质量对木聚糖结晶能力的影响，以期为木聚糖的性能调控及高值化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

木聚糖(提取自甘蔗渣),购自上海源叶生物科技有限公司。木聚糖酶(内切酶)，酶活10 000 U/mg，上海麦克林公司。醋酸、醋酸钠、乙醇等药品，均为市售分析纯。

AT-100D恒温培养摇床；LSH-50CL恒温恒湿箱；IC-3000型高效离子色谱，配备阴离子交换柱CarboPacTMPA20, 美国Dionex公司；Agilent PL-GPC 50凝胶渗透色谱(GPC)，美国Agilent公司；TG209F1热重分析仪，德国耐驰公司；X’Pert Powder X射线衍射(XRD)仪，荷兰Eindhoven公司；LY-SSR转子黏度计，上海方瑞仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1不同相对分子质量木聚糖的制备 参考文献[13]利用内切木聚糖酶制备不同相对分子质量的木聚糖样品。将0.02 g木聚糖酶溶于100 mL蒸馏水中，在室温下完全溶解得到木聚糖酶溶液。将5 g木聚糖粉末、250 mL醋酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH值 4.8)置于500 mL蓝口玻璃瓶中，充分搅拌0.5 h，之后加入2.5 mL木聚糖酶溶液，并将其置于40 ℃的AT-100D恒温培养摇床以300 r/min分别振荡1.5、2.5、3.5、4.5、6.5和8.5 h。反应完毕后，将蓝口瓶置于105 ℃烘箱中约7 min，进行灭活。冷却至室温后，加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀。分离后用70%乙醇对固体沉淀进行多次洗涤，之后冻干，得到不同相对分子质量的粉末状木聚糖样品。根据酶处理时间由短到长(1.5～8.5 h)，酶处理的木聚糖样品被分别命名为X1、X2、X3、X4、X5和X6，未经处理的木聚糖则用X0表示。

在室温下将X1～X6样品分别溶解于质量分数2%及4% NaOH溶液中，用5 mol/L的HCl将溶液pH值调节为5.5，之后倒入3倍体积的无水乙醇中，使木聚糖样品再次沉淀出来，分离、洗涤、冻干后将2% NaOH溶解再沉淀样品分别命名为RLX1～RLX6，将4% NaOH溶解再沉淀样品分别命名为RHX1～RHX6。

1.2.2木聚糖水铸膜的制备 将0.6 g木聚糖粉末分散于8 mL去离子水中，得到质量浓度75 g/L的分散液。将分散液于90 ℃下搅拌30 min，转速为350 r/min。搅拌结束后，将分散液倒入聚四氟乙烯模具(65 mm×40 mm)中，于LSH-50CL恒温恒湿箱中以温度50 ℃、相对湿度70%干燥24 h。

1.3 分析与表征

1.3.1木聚糖的化学组分 根据文献[4]的方法对木聚糖进行水解。木聚糖水解液中的中性糖含量由IC-3000型高效离子色谱测定。用200 mmol/L NaOH溶液对色谱柱进行冲洗，再用水、20 mmol/L NaOH溶液和500 mmol/L乙酸钠溶液以0.5 mL/min的流速梯度洗脱。

1.3.2木聚糖相对分子质量 利用Agilent PL-GPC 50凝胶渗透色谱测定木聚糖的重均相对分子质量(Mw)和数均相对分子质量(Mn)，考察木聚糖的分散性指数(PDI)。约5 mg的木聚糖粉末溶解于1.5 mL流动相，检测进样量为100 μL，柱温为40 ℃，流动相为二甲基亚砜(DMSO)溶液，流速为0.6 mL/min。用聚甲基丙烯酸甲酯/聚苯乙烯标准品作相对分子质量标准曲线，标准品相对分子质量分别为4 880、13 750、41 570、237 000和400 600。

1.3.3木聚糖热稳定性 木聚糖粉末样品热稳定性通过TG209F1热重分析仪测定。温度变化范围为室温至500 ℃，升温速率为10 ℃/min，实验气氛为氮气。

1.3.4XRD分析 由对称反射模式的X’Pert Powder X射线衍射仪测定，配备在40 kV和40 mA下工作的铜X射线源(k=0.154 18 nm)。冻干后的木聚糖粉末样品被装入中心孔深为200 μm的粉末样品台上。轻轻按压样品后，用平刃将高于平台表面的多余样品擦掉。

1.3.5木聚糖分散液黏度 约1 g的木聚糖粉末充分分散于9 mL的2% NaOH溶液中配置成固含量为10%的木聚糖分散液。取适量体积溶液，用LY-SSR转子黏度计在30～100 r/min的剪切速率范围内测定分散液的黏度。每份分散液黏度测量2次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 酶处理对木聚糖相对分子质量的影响

选取的蔗渣木聚糖前期的研究[4]已经对其进行了化学组分及水溶性分析，其含有76.5%的木糖，7.5%的阿拉伯糖以及3.9%的葡萄糖醛酸，具有较高的木糖含量，支链度较低，不具有乙酰基，且水溶性较低。酶处理及酶-碱处理后木聚糖的化学组分及相对分子质量见表1。

表1 酶处理及酶-碱处理后木聚糖的化学组分及相对分子质量

从表1中可以得知，随着酶解时间的增加，木聚糖样品的相对分子质量不断降低。酶解1.5 h后，木聚糖Mw及Mn分别由原料木聚糖的58 000和17 500显著降低至32 700和7 900，说明内切木聚糖酶处理能够有效降低木聚糖的相对分子质量。然而，酶解处理超过2.5 h后，虽然木聚糖的Mn继续降低，但是木聚糖的Mw变化不大；反映在木聚糖聚合物分散性指数(PDI)上，PDI随酶解时间增加而增大，从原料木聚糖的3.31增大至酶解木聚糖的4.14～6.12，说明木聚糖酶解为非均相反应，这是本研究选取的木聚糖水溶性较低的缘故。木聚糖聚集态结构中靠外或较松散的部分被率先酶解，造成相对分子质量显著降低；而随着酶解时间增加，酶分子仍然难以进入木聚糖聚集态结构中结晶或者结合较紧密的部分，只能继续酶解易酶解部分，生成许多小相对分子质量片段，导致Mn持续降低，而PDI持续升高。木聚糖的化学组分分析显示，不同酶解时间处理的木聚糖的阿拉伯糖/木糖质量比有轻微波动，但是在离子色谱测量误差范围内，不能做出木聚糖化学组分产生变化的判断(表1)。因此，总体上来说，内切木聚糖酶处理对木聚糖化学组分影响较小，这是由于内切木聚糖酶的作用机理为切断木聚糖主链上的β-1,4-糖苷键，对阿拉伯糖支链基团的影响较小[14]。

2.2 木聚糖结晶能力分析

木聚糖酶处理后样品的XRD分析可见图1(a)。从图可以看出，未经酶处理的木聚糖(X0)具有明显的木聚糖水合晶XRD特征峰，且结晶度较高，这是其支链度较低所致，与先前的研究结果相符合[4]。酶处理1.5 h的木聚糖(X1)在相对分子质量有较大程度降低的情况下仍保持明显的XRD特征峰，进一步说明非均相木聚糖酶解过程首先是非晶部分的酶解。酶解处理超过2.5 h后，随着酶解时间的增加，木聚糖XRD特征峰的半峰宽变大，部分特征峰变得不明显，说明其结晶度逐渐减小[15]。因此，可以推断，长时间非均相酶解处理虽然不能大幅降低木聚糖相对分子质量，但是会对木聚糖结晶结构造成一定破坏。然而，X3～X6木聚糖结晶度虽然有所降低，但可看出仍保留有一定的结晶结构，特别是110晶面的特征峰仍然明显，说明木聚糖结晶结构中的110晶面难以被酶破坏。

木聚糖的酶处理为非均相反应，对结晶结构的破坏并不能反映其对木聚糖结晶能力的影响，因此将酶处理后的木聚糖在碱溶液里溶解或分散并重新沉淀，观察木聚糖结晶能力的变化。将木聚糖溶解并重新沉淀的过程可以视为其重结晶过程。将木聚糖样品使用2% NaOH溶液处理，样品均匀地分散在溶液中，但并未完全溶解，为黄色悬浮液。使用无水乙醇沉淀并冻干之后进行XRD分析，与酶解之后直接沉淀得到的木聚糖样品(X系列)相比，RLX1和RLX2样品结晶度进一步降低，其他RLX样品的结晶度未发生明显变化(图1(b))。将X系列木聚糖样品使用4% NaOH溶液处理，所有样品均全部溶解，为黄色透明溶液。沉淀后得到的木聚糖样品RHX1～RHX6均具有与未处理木聚糖相同的木聚糖水合晶XRD特征峰，且峰型均较为尖锐，具有与未处理木聚糖相似的结晶度(图1(c))。对碱溶解或分散并重新沉淀的木聚糖进行化学组成及相对分子质量分析，可以发现阿拉伯糖/木糖质量比、相对分子质量、PDI等与碱处理之前的木聚糖样品相比几乎没有变化(表1)，这可能是由于碱处理是在室温下进行，并且时间较短，因而对木聚糖化学结构影响较小，可以排除碱处理后木聚糖结晶度变化是由于其化学结构变化所致。

a.木聚糖酶xylanase；b.木聚糖酶xylanase+2% NaOH；c.木聚糖酶xylanase+4% NaOH

内切木聚糖酶可以切断木聚糖链，从而破坏木聚糖的水合晶结构，造成了木聚糖结晶度的降低(图1(a))。由于碱能破坏木聚糖分子间的氢键，因此2% NaOH处理后，木聚糖的结晶度进一步降低(图1(b))。由于酶处理及2% NaOH分散均为非均相反应，木聚糖分子链不能进行自由运动，分子链的排列未能进行重构，因此仅能说明木聚糖的结晶结构受到了破坏，并不能说明其结晶能力的变化。当提高碱溶液的质量分数，使用4% NaOH溶液对木聚糖进行处理时，木聚糖能够完全溶解，分子链能够自由运动、排列，在重新沉淀过程中木聚糖分子链可重新规整排列，因此能够分析出木聚糖结晶能力的变化。结果显示：4% NaOH溶解的酶处理木聚糖，重新沉淀后再度形成完整的木聚糖水合晶结构(图1(c))。由此可知，非均相的酶解处理能够通过破坏木聚糖分子链干扰木聚糖的结晶结构，但是并不能降低其结晶能力，因此当相对分子质量降低的木聚糖分子重新规整排列之后，完整水合晶结构再度出现。

2.3 分散液黏度分析

将部分经过酶解后的木聚糖样品充分分散于2% NaOH溶液中，并测定分散液黏度，结果数据可见图2。从图2可以清晰看出，随着剪切速率的升高，原料木聚糖分散液的黏度由110 mPa·s逐步降低为77 mPa·s。与未改性的木聚糖相似，X1～X4分散液同样出现了剪切变稀现象。剪切变稀现象的出现是在静止状态下，木聚糖分子上的羟基与水分子形成的氢键随着剪切速率的增大而逐步被破坏所致[16-17]。因此，酶解作用并不会改变木聚糖流体性质，即其剪切稀化特性；酶解木聚糖黏度的依次降低可再次证明木聚糖平均相对分子质量的降低(表1)。

图2 10%固含量木聚糖分散液黏度

2.4 成膜性能分析

未处理的木聚糖及经酶处理的木聚糖样品(X1～X6)均未能形成完整水铸膜，当铸膜液中的水分挥发后，薄膜呈碎裂状，如图3所示。由图可见，干燥后X4～X6(图3(b)～(d))碎膜的裂纹间隙小于X1(图3(a))，这可能是由于X4～X6木聚糖的结晶度小于X1所致。但X4～X6木聚糖仍保留有一定的结晶结构，因此未能形成完整薄膜。这与本课题组前期的研究发现相符，木聚糖的水合结晶抑制其水铸膜的成膜性能[4]，图3所示结果再次证明此结论。

a.X1；b.X4；c.X5；d.X6

2.5 热稳定性能分析

酶处理木聚糖X1～X4的TG/DTG曲线见图4。由图可知，在温度小于100 ℃时，样品中的水分率先蒸发。原料木聚糖X0及经酶处理的木聚糖样品X1～X4分别于282、278、276、274和267 ℃开始降解。随着平均相对分子质量的降低，木聚糖的起始分解温度也随之降低；木聚糖的相对分子质量越小，破坏木聚糖分子结构所需能量更低，因此其起始分解温度更低。5种木聚糖样品的最高降解速率温度均在304～308 ℃之间，差异性不大。总的来说，不同木聚糖样品的起始分解温度差距在15 ℃以内，区别不大，而最能反映热稳定性的最高降解速率温度差距更是在4 ℃以内，说明木聚糖的相对分子质量对其热稳定性影响不大。

图4 木聚糖的TG(a)和DTG(b)曲线

3 结 论

3.1对木聚糖进行非均相的木聚糖酶处理，木聚糖化学结构(阿拉伯糖/木糖质量比值)没有显著变化，而相对分子质量变化较大；酶处理2.5 h后，木聚糖Mw从58 000降至25 700，Mn从17 500降至5 400，PDI从3.31升高至4.73；之后，随着酶处理时间进一步延长至8.5 h，木聚糖Mw变化不大，Mn继续下降至3 400，PDI继续升高至6.12。

3.2X射线衍射(XRD)分析表明：非均相的木聚糖酶处理以及进一步的非均相碱液(2% NaOH溶液)处理使木聚糖水合晶的大部分特征峰的峰强变弱，结晶度降低，说明其水合晶结构遭到破坏。将不同相对分子质量的酶处理木聚糖完全溶解于4% NaOH溶液，使其分子链能够自由运动及重新排列，重新沉淀后的木聚糖XRD谱图显示：木聚糖水合晶完整的结晶结构能够再度形成，且具有较高的结晶度，说明非均匀地降低木聚糖的相对分子质量对其水合结晶能力没有明显影响。

3.3木聚糖平均相对分子质量的降低没有显著改变木聚糖的热稳定性及剪切稀化的流变性质，但是黏度随着相对分子质量的降低而降低；在50 r/min的剪切速率下，黏度从未处理木聚糖的约100 mPa·s降至X4木聚糖的约20 mPa·s。

3.4酶处理木聚糖的水铸膜成膜性能仍然受其结晶的抑制，单纯降低相对分子质量并没有改善其水铸膜成膜性能。