洋紫荆粉色花的化学成分及其酪氨酸酶抑制活性研究

梁 蒙，王亚凤，谢桃结，朱鸿杰，黄永林*

(1.桂林医学院，广西 桂林 541004；2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所；广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西 桂林 541006；3.柳州市园林科学研究所，广西 柳州 545005)

宫粉羊蹄甲，俗名洋紫荆，属于豆科羊蹄甲属落叶乔木[1-2]。洋紫荆一般生长在多山或多坡地区，在落叶林和混交林中也有分布。洋紫荆树冠雅致，花大而艳丽，且花期较长，通常在1月至4月开放[3-4]，是一种优良观花园林植物，现作为柳州市市花在柳州市区绿地、公园、道路两旁大量栽种。洋紫荆的根、茎皮、叶和花有着悠久的民间药用历史，茎皮可以用于治疗消化不良和急性肠胃炎，花具有清热解毒、止咳平喘、消炎等功效[5]。化学成分研究表明，洋紫荆中含有黄酮类、三萜类、甾体类、生物碱、菲醌类、酚酸类等成分[6]。现代药理研究发现洋紫荆提取物具有抑制B16F10黑色素瘤小鼠肿瘤增长及抗氧化作用，洋紫荆提取物中的生物碱类成分具有抑制K562细胞增殖和诱导细胞凋亡作用[7-9]。目前有关洋紫荆花化学成分的研究较少[10]，同时，洋紫荆花又分为白色、粉色、红色、紫色等4种花色，且鲜明易鉴，不同花色主成分是什么、相互间的成分差别是否显著等值得研究。Toyopearl Butyl-650C层析柱，是一种甲基丙烯酸聚合物，具有很高的化学稳定性，可用于离子交换、疏水作用或亲和分离等替代色谱模式，650C型粒径为100 μm，适用于亲水性或者水溶性较大的酚酸类分离；Chromatorex C18层析柱为硅胶柱，吸附量小，适合分离螯合化合物和酸、碱性化合物，是正、反相分析及制备HPLC和MPLC的理想填料；MCI gel CHP 20P基体是聚苯乙烯和二乙烯基共聚物或聚甲基丙烯酸酯，可用于反相色谱分离，CHP树脂高分介质的化学稳定性好，可以满足提高分离效率和精细分离的需要。因此，本研究采用多种类型层析柱对洋紫荆粉色花的甲醇提取物中水溶性部分进行了成分分离，共分离得到14个化合物，并进一步运用酪氨酸酶催化左旋多巴氧化速率法对14个化合物的酪氨酸酶抑制活性进行了筛选，用以评价其抑制酪氨酸酶活性的能力，以期为洋紫荆花的进一步开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

洋紫荆粉色花，采自广西柳州市，经柳州市园林科学研究所刘思鉴定为洋紫荆(BauhiniavariegataL.)的粉色花，凭证样品(2020.03.18)存放于广西植物功能物质研究与利用重点实验室。曲酸、左旋多巴(L-DOPA)，上海源叶生物科技有限公司；酪氨酸酶，上海麦克林生化科技有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，北京索莱宝科技有限公司；乙醇、甲醇等，均为市售分析纯。

Bruker Avance 500 MHz超导核磁共振波谱仪，德国Bruker公司；LC52半制备液相色谱仪，北京赛谱锐思公司；WFH-203紫外分析仪，上海精科实业有限公司；F254硅胶薄层板(0.2 mm)、GF254薄层色谱硅胶，德国Merck公司；Toyopearl Butyl-650C层析柱(100 μm)、Toyopearl HW-40F层析柱(30～60 μm)，日本TOSOH公司；Sephadex LH-20层析柱(25～100 μm)，瑞士GE Healthcare Bio-Science公司；Chromatorex C18层析柱，日本Fuji Silysia Chemical公司；MCI gel CHP 20P层析柱(75～150 μm)、Diaion HP20SS层析柱(75～150 μm)，日本Mistubishi Chemical公司。

1.2 提取与分离

取新鲜洋紫荆粉色花33.1 kg用纯甲醇室温浸提3次，每次50 L，每次7 d，合并提取液并过滤，减压浓缩后得浸膏1 344.89 g，加水溶解后用石油醚萃取3次，水溶液部分经Diaion HP20层析柱(10 cm×65 cm)分离，甲醇-水(0→100%，每10%为1梯度)为洗脱剂梯度洗脱，得到Fr.1～Fr.7共7个组分。Fr.2(156.01 g)经Sephadex LH-20层析柱分离，甲醇-水(0→100%，每10%为1梯度)为洗脱剂梯度洗脱，得到7个组分：Fr.2.1～Fr.2.7。Fr.2.2(9.30 g)经Chromatorex C18、Diaion HP20SS、Sephadex LH-20等柱色谱反复层析分离纯化得到化合物10(10 mg,洗脱液为甲醇/水，体积比8∶2)。Fr.2.5(0.21 g)经Toyopearl Butyl-650C、Toyopearl HW-40F、Chromatorex C18等柱色谱反复层析分离纯化得到化合物1(16 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比8∶2)；由于分离得到化合物温度和纯度没有达到结晶的条件，因此只是粉末状。Fr.2.6(0.10 g)经半制备HPLC(C18，10 mm×250 mm，5 μm)色谱分离得到化合物2(10 mg，洗脱液为乙腈/水，体积比2∶8)。Fr.2.7(0.30 g)经Diaion HP20SS、Sephadex LH-20等柱色谱反复层析分离纯化得到化合物9(8 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比3∶7)、7(12 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比5∶5)、5(15 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比8∶2)、6(15 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比8∶2)。Fr.3(17.71 g)经Sephadex LH-20层析柱层析，甲醇-水(0→100%，每10%为1梯度)为洗脱剂梯度洗脱，得到8个组分：Fr.3.1～Fr.3.8。Fr.3.2(0.22 g)在甲醇、水溶液中析出晶体，过滤得到化合物11(22 mg)。Fr.3.3(0.15 g)经半制备HPLC(C18，10 mm×250 mm，5 μm)色谱分离得到化合物12(8 mg，洗脱液为乙腈/水，体积比3∶7)。Fr.3.4(0.15 g)经Chromatorex C18、Diaion HP20SS、Sephadex LH-20等柱色谱反复层析分离纯化得到化合物3(12 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比8∶2)。Fr.3.6(0.18 g)经Sephadex LH-20、Toyoperal Butyl-650C、Diaion HP20SS等柱色谱反复层析分离纯化得到化合物4(18 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比8∶2)、8(17 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比6∶4)、13(10 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比8∶2)。Fr.4(63.71 g)经MCI层析柱，甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到5个组分：Fr.4.1～Fr.4.5。Fr.4.1(42.50 g)经Diaion HP20SS、Sephadex LH-20等柱色谱反复层析分离纯化得到化合物14(20 mg，洗脱液为甲醇/水，体积比8∶2)。

1.3 酪氨酸酶抑制活性测试

参考酪氨酸酶催化L-DOPA氧化速率的方法测试14个化合物的酪氨酸酶抑制活性。以0.2 mol/L PBS为溶剂，配置100 U/mL的酪氨酸酶溶液，以曲酸为阳性对照。将部分样品配制成不同质量浓度的溶液，以96孔板为载体，实验分为4个组：样品组、样品背景对照组、空白组和空白对照组。

向96孔板中依次加入样品溶液20 μL和酪氨酸酶溶液10 μL，每个样品孔均设置3个复孔作平行对照。混合均匀后置于37 ℃水浴中孵育10 min，接着加入40 μL的L-DOPA溶液，继续于37 ℃水浴中孵育5 min 后，于475 nm 波长下测定吸光度值，得到样品组吸光度值(A1)；以10 μL 的PBS替代10 μL的酪氨酸酶溶液，重复以上步骤，测得样品背景对照组吸光度值(A2)；以20 μL的PBS替代20 μL的样品溶液，测得空白组吸光度值(A3)；以30 μL的PBS替代20 μL的样品溶液和10 μL 的酪氨酸酶溶液，测得空白对照组吸光度值(A4)。所有试验均重复3次。

按照下式计算酪氨酸酶抑制率(η)，并用SPSS软件计算半数抑制质量浓度(IC50)值。

η=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化合物1：白色粉末，C6H6O2。ESI-MS(m/z)：110.039[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.88(2H，d，J=8.5 Hz，H-4，5)，6.80(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，6)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：163.2(2C，C-1，2)，132.9(2C，C-4，5)，115.1(2C，C-3，6)。上述数据与文献[11]对照基本一致，故鉴定化合物1为邻苯二酚。

化合物2：白色针晶，C7H6O4。ESI-MS(m/z)：154.029[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.44(1H，brs，H-2)，7.41(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.79(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：170.3(—COO)，151.5(C-4)，146.0(C-3)，123.9(C-6)，123.2(C-1)，117.7(C-5)，115.8(C-2)。上述数据与文献[12]对照基本一致，故鉴定化合物2为原儿茶酸。

化合物3：白色针晶，C7H6O3。ESI-MS(m/z)：138.032[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.86(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)，6.80(2H，d，J=8.8 Hz，H-3，5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：170.3(—COO)，163.3(C-4)，132.9(2C，C-2，6)，123.0(C-1)，116.0(2C，C-3，5)。上述数据与文献[13]对照基本一致，故鉴定化合物3为对羟基苯甲酸。

化合物4：无色针晶，C9H10O4。ESI-MS(m/z)：182.060[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.69(1H，dd，J=3.5，6.0 Hz，H-3)，6.60～6.62(2H，m，H-5，6)，3.67(3H，s，—OCH3)，3.61(2H，s，H-7)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：174.7(C-8)，146.2(C-4)，145.0(C-1)，122.7(C-2)，120.3(C-6)，118.5(C-3)，115.3(C-5)，52.3(—OCH3)，36.3(C-7)。上述数据与文献[14]对照基本一致，故鉴定化合物4为2，5-二羟基苯乙酸甲酯。

化合物5：棕色粉末，C9H8O3。ESI-MS(m/z)：164.050[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.56(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.43(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，6.80(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，6.27(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：171.6(C-9)，160.9(C-4)，146.1(C-7)，130.9(2C，C-2，6)，127.4(C-1)，115.8(2C，C-3，5)，115.1(C-8)。上述数据与文献[15]对照基本一致，故鉴定化合物5为反-对香豆酸。

化合物6：棕色粉末，C9H8O3。ESI-MS(m/z)：164.050[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.57(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，6.72(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.66(1H，d，J=12.8 Hz，H-7)，5.78(1H，d，J=12.8 Hz，H-8)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：171.6(C-9)，159.3(C-4)，132.9(C-1)，130.2(2C，C-2，6)，130.1(C-7)，127.4(C-8)，116.0(2C，C-3，5)。上述数据与文献[15]对照基本一致，故鉴定化合物6为顺-对香豆酸。

化合物7：黄色晶体，C9H8O4。ESI-MS(m/z)：180.038[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.55(1H，d，J=15.8 Hz，H-7)，7.04(1H，d，J=1.5 Hz，H-2)，6.92(1H，dd，J=1.5，8.1 Hz，H-6)，6.79(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，6.24(1H，d，J=15.8 Hz，H-8);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：171.1(C-9)，149.4(C-4)，147.0(C-3)，146.7(C-7)，127.8(C-1)，122.9(C-6)，116.5(C-5)，115.5(C-8)，115.1(C-2)。上述数据与文献[16]对照基本一致，故鉴定化合物7为咖啡酸。

化合物8：白色粉末，C11H12O4。ESI-MS(m/z)：208.071[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.54(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.05(1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，6.95(1H，dd，J=1.7，8.2 Hz，H-6)，6.77(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.25(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，4.60(2H，d，J=7.5 Hz，H-10)，1.25(3H，t，J=7.5 Hz，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：168.7(C-9)，149.6(C-4)，147.1(C-3)，146.8(C-7)，127.8(C-1)，123.0(C-6)，116.8(C-5)，115.3(C-8)，115.2(C-2)，72.0(C-10)，38.2(C-11)。上述数据与文献[17]对照基本一致，故鉴定化合物8为咖啡酸乙酯。

化合物9：淡黄色粉末，C10H10O4。ESI-MS(m/z)：194.058[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.61(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，7.18(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，7.07(1H，dd，J=1.9，8.2 Hz，H-6)，6.82(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.33(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，3.89(3H，s，OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：171.2(—COO)，150.4(C-3)，149.4(C-4)，146.8(C-7)，127.9(C-1)，123.9(C-6)，116.5(C-5)，116.2(C-8)，111.7(C-2)，56.4(—OCH3)。上述数据与文献[18]对照基本一致，故鉴定化合物9为阿魏酸。

化合物10：白色固体，C13H18O8。ESI-MS(m/z)：302.101[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.60～7.63(2H，m，H-5，6)，7.17(1H，d，J=8.5 Hz，H-3)，5.77(1H，d，J=6.2 Hz，H-1′)，4.53(1H，d，J=12.5 Hz，H-6′a)，3.86～3.90(4H，m，H-2′，4′，5′，6′b)，3.68～3.71(1H，m，H-3′)，3.41(3H，s，—OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：151.1(C-1)，150.1(C-2)，123.3(C-6)，123.1(C-3)，116.4(C-5)，114.6(C-4)，102.2(C-1′)，78.9(C-5′)，78.3(C-3′)，74.8(C-2′)，71.3(C-4′)，62.5(C-6′)，56.7(—OCH3)。上述数据与文献[19]对照基本一致，故鉴定化合物10为愈创木酚-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物11：白色粉末，C13H16O8。ESI-MS(m/z)：300.080[M]+。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ：7.86(2H，d，J=8.7 Hz，H-2，6)，6.86(2H，d，J=8.7 Hz，H-3，5)，5.52(1H，d，J=7.4 Hz，H-1′)，3.10～3.81(6H，m，H-2′，3′，4′，5′，6′a，6′b)；13C NMR(125 MHz，DMSO)δ：164.6(—COO)，162.4(C-4)，132.1(2C，C-2，6)，119.9(C-1)，115.5(2C，C-3，5)，94.6(C-1′)，77.9(C-5′)，76.6(C-3′)，72.6(C-2′)，69.6(C-4′)，60.7(C-6′)。上述数据与文献[20]对照基本一致，故鉴定化合物11为对羟基苯甲酸葡萄糖酯。

化合物12：无色油状物，C14H16O6。ESI-MS(m/z)：280.091[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.57(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，7.06(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.95(1H，dd，J=2.0，8.2 Hz，H-6′)，6.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.29(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，5.36～5.40(1H，m，H-1)，4.15(1H，m，H-2)，3.69(1H，m，H-3)，2.06～2.16(4H，m，H-4a，H-4b，H-5a，H-5b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：169.1(C-6)，149.5(C-4′)，146.9(C-3′)，146.8(C-8)，127.8(C-1′)，122.9(C-6′)，116.5(C-5′)，115.5(C-7)，115.1(C-2′)，74.8(C-2)，72.7(C-1)，72.5(C-3)，40.2(C-4)，38.9(C-5)。上述数据与文献[21]对照基本一致，故鉴定化合物12为2,3-二羟基环戊基-3-(3′,4′-二羟基苯基)丙烯酸酯。

化合物13：白色粉末，C16H18O9。ESI-MS(m/z)：354.101[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.54(1H，d，J=15.8 Hz，H-9)，7.05(1H，d，J=1.7 Hz，H-2′)，6.94(1H，dd，J=1.7，8.2 Hz，H-6′)，6.77(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.25(1H，d，J=15.8 Hz，H-8)，5.33(1H，m，H-3)，4.18(1H，m，H-5)，3.72(1H，dd，J=2.7，8.5 Hz，H-4)，2.22(1H，m，H-6a)，2.16(2H，m，H-2)，2.06(1H，m，H-6b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：175.9(—COO)，167.4(C-7)，148.2(C-4′)，145.8(C-3′)，145.4(C-9)，126.5(C-1′)，121.6(C-6′)，115.1(C-5′)，113.9(C-8)，113.9(C-2′)，74.9(C-1)，72.2(C-4)，70.6(C-3)，70.02(C-5)，37.5(C-2)，36.9(C-6)。上述数据与文献[22]对照基本一致，故鉴定化合物13为绿原酸。

化合物14：浅黄色粉末，C21H20O11。ESI-MS(m/z)：448.377[M]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.36(1H，brs，H-2′)，6.89(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.55(1H，s，H-3)，6.49(1H，s，H-8)，4.91(1H，s，H-1″)，3.47～4.60(6H，m，H-2″，H-3″，H-4″，H-5″，H-6″a，H-6″b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：184.0(C-4)，166.3(C-2)，164.9(C-7)，162.0(C-5)，158.7(C-9)，151.1(C-4′)，147.1(C-3′)，123.5(C-1′)，120.3(C-6′)，116.8(C-5′)，114.1(C-2′)，109.2(C-6)，105.2(C-10)，103.9(C-3)，95.2(C-8)，82.6(C-5″)，80.1(C-3″)，75.3(C-1″)，72.6(C-2″)，71.7(C-4″)，62.8(C-6″)。上述数据与文献[23]对照基本一致，故鉴定化合物14为异荭草苷。

鉴定的14个化合物结构式见图1，其中化合物5、6、9、10、11、12、14为首次从该植物中分离得到。

图1 化合物1～14的结构式

2.2 化合物对酪氨酸酶抑制活性的筛选结果

采用酪氨酸酶催化左旋多巴(L-DOPA)氧化速率的方法，对从洋紫荆粉色花的水溶性部分中分离得到的14个化合物进行体外酪氨酸抑制活性的筛选，当质量浓度为4 g/L时，化合物1～14的酪氨酸酶抑制率分别为11.9%、39.2%、16.5%、6.8%、2.3%、4.2%、29.6%、14.3%、3.0%、7.8%、1.2%、19.8%、10.5%和9.5%。其中，阳性对照曲酸的IC50值为(0.696±0.298)×10-4g/L，相比而言，化合物2的酪氨酸酶抑制活性最好，其IC50值为(4.804±0.939)g/L，其次是化合物7，其IC50值为(7.339±0.549)g/L，其余化合物的IC50值均大于8 g/L，没有明显的酪氨酸酶抑制活性。不同质量浓度条件下，化合物2和7对酪氨酸酶抑制率的影响如图2所示。由图2可知，化合物2和7对L-DOPA的清除率与质量浓度成正的量效关系，表明其酪氨酸酶抑制活性随着化合物质量浓度的提高而增强。

图2 不同质量浓度时化合物2和7对酪氨酸酶的抑制作用

通过查阅文献发现，分离得到的化合物2和7有不同程度的抗炎、抗氧化、抗病毒等生物活性。研究发现原儿茶酸(2)对金黄色葡萄球菌性肺炎和过敏性哮喘有一定的治疗作用，对MCF-7细胞株有显著的细胞毒性，此外还有较强的抗氧化及防治肝纤维化等作用[24-25]；咖啡酸(7)可通过抑制玉米属(ZEA)诱导的细胞凋亡，恢复颗粒细胞活性，能抑制晚期糖化终末产物所诱导的炎症、凝血及抗凝血、抗病毒、抗氧化等作用[26-27]。因此，推测化合物2和7表现出一定的酪氨酸酶抑制活性与其结构有一定的相关性。本研究为洋紫荆花抗炎、抗癌、抗氧化、抗菌等药理活性提供了物质基础，但是否为主要活性成分还有待于深入研究加以证明。

3 结 论

从洋紫荆粉色花甲醇提取物水溶液部位分离鉴定了14个化合物，通过结构鉴定并与文献数据对比，分别为邻苯二酚(1)、原儿茶酸(2)、对羟基苯甲酸(3)、2，5-二羟基苯乙酸甲酯(4)、反-对香豆酸(5)、顺-对香豆酸(6)、咖啡酸(7)、咖啡酸乙酯(8)、阿魏酸(9)、愈创木酚-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)、对羟基苯甲酸葡萄糖酯(11)、2，3-二羟基环戊基-3-(3′,4′-二羟基苯基)丙烯酸酯(12)、绿原酸(13)、异荭草苷(14)。采用酪氨酸酶催化左旋多巴氧化速率的方法，测试了14个化合物的酪氨酸酶抑制活性。结果表明：化合物2和7的抑制活性相对较好，IC50值分别为(4.804±0.939)g/L和(7.339±0.549)g/L，并且表现出正的量效关系。本研究丰富了洋紫荆粉色花的化学成分多样性，并为洋紫荆花的开发与利用提供了一定的理论依据。