基于NADPH/ROS/ERK信号通路探讨肾康降酸颗粒对高尿酸血症大鼠肾小管上皮细胞损伤的作用机制

徐梅秀，薛丕良，黄 芳，伊世华，李丽琦

(黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

高尿酸血症是指正常嘌呤饮食情况下血清尿酸水平超过正常阈值，通常定义为男性高于416 μmol/L(7 mg/dL)，女性高于357 μmol/L(6 mg/dL)。随着经济的快速发展和饮食结构的改变，我国高尿酸血症发病率呈现逐年上升的趋势。据流行病学调查结果显示，我国高尿酸血症的患病率在10%以上，其中东南沿海以及经济发达地区高尿酸血症患病率甚至高于20%，与欧美发达国家情况相接近[1-3]。肾康降酸颗粒为本院治疗高尿酸血症以及高尿酸血症相关性肾病的临床常用方，其主要活性成分黄芪多糖、大黄酸、姜黄素、丹参多酚酸盐均能从多途径、多靶点有效调控尿酸代谢和改善肾小管上皮细胞损伤[4-6]。本课题组前期研究发现肾康降酸颗粒可以有效降低肾组织中TGF-β1、TNF-α的表达水平，从而抑制尿酸盐在管小管沉积，改善肾组织损伤[7]。本研究通过观察肾康降酸颗粒对高尿酸血症大鼠NADPH/ROS/ERK信号通路的影响，旨在进一步研究肾康降酸颗粒对高尿酸血症大鼠肾功能与肾小管上皮细胞的保护效应。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量200～240 g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(黑)2013-004，使用许可证号：SYXK(黑)2013-012。饲养于黑龙江省中医药科学院动物实验室，环境湿度(55±15)%，温度20～24 ℃，给予大鼠昼夜各12 h的昼夜循环。

1.2药品与试剂 肾康降酸颗粒由黑龙江省中医药科学院制剂室提供(组成：黄芪10 g、山药6 g、大黄3 g、姜黄4 g、土茯苓6 g、威灵仙6 g、丹参6 g、泽兰4 g、地龙6 g、白花蛇舌草6 g、薏苡仁6 g、牛膝4 g)，每袋10 g(含生药67 g，批号：20180711)。别嘌呤醇由上海信宜万象药业有限公司生产(国药准字H31020334，0.1 g/片，批号：181107)。大鼠尿酸、肌酐和尿素氮检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司(批号分别为20180125，20180627和20180530)；活性氧(ROS)测定试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所(批号分别为20180315，20180122和20180611)；兔抗鼠ERK1、p-ERK1、β-actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗均购于沈阳万类生物科技有限公司(批号分别为WL01770，WLP1512，WL01372和WLA023)；腺嘌呤与酵母粉购自Singma公司(批号分别为3204100和101498252)。

1.3仪器设备 光学显微镜(尼康株式会社，日本)；电泳仪、电泳槽及凝胶成像分析系统(Bio-Rad，美国)；DNX-9620A洗板机(北京普朗医疗)；RT-610酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；BD FACSCalibur 流式细胞仪(BD，美国)。

1.4实验方法 随机取10只雄性SD大鼠作为空白组，其余30只大鼠采用腺嘌呤联合酵母粉灌胃口服制备高尿酸血症模型，方法参考文献[8]：取适量腺嘌呤与酵母粉溶解于生理盐水中，制备每毫升含有5 mg腺嘌呤与0.5 g酵母粉混合溶液，将对应剂量的酵母粉与腺嘌呤分2次灌胃，连续灌胃14 d。空白组大鼠每日给予2次等体积的生理盐水灌胃，每次2 mL。造模结束后，眼眶取血检测血清尿酸(≥110 μmol/ L)、肌酐和尿素氮水平判断是否造模成功。将造模成功大鼠随机分成模型组、别嘌呤醇组、肾康降酸颗粒组，每组10只。自造模结束后第2天起，别嘌呤醇组大鼠给予27 mg/(kg·d)别嘌呤醇水混液灌胃，肾康降酸颗粒组给予3.24 g/(kg·d)的肾康降酸颗粒溶液灌胃，空白组和模型组大鼠给予生理盐水2 mL/d灌胃，均持续灌胃6周。

1.5样本采集 末次灌胃结束后，大鼠常规禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血5 mL，3 000 r/min离心15 min分离出血清并于-80 ℃保存。游离大鼠双肾，剥离肾周纤维组织并冲洗，左肾上1/2置于10%福尔马林溶液常温固定，用于组织病理检查；左肾下1/2于液氮中保存，用于Western blot检测。取右肾分离肾皮质，弃髓质，将皮质剪碎至1 mm×1 mm，PBS反复冲洗以洗清残余血液成分，0.1%的Ⅱ型胶原酶震荡消化，收集消化液。PBS洗涤剪碎后的组织，收集洗涤液。将洗涤液和消化液混匀，滤网过滤后离心收集沉淀。PBS清洗2次，DMEM/F12悬浮，离心管中加入Percoll分离液后加入上述混悬液，离心、纯化肾小管节段。肾小管节段于培养皿中接种培养，制备肾小管上皮细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，免疫组化染色检测CK18蛋白的表达，以CK18阳性表达鉴定为成功分离肾小管上皮细胞。随后调整细胞浓度为109/L用于检测。

1.6检测指标及方法

1.6.1血肌酐、尿素氮、尿酸水平检测 取血清，按照试剂盒说明书，采用ELISA法检测各组大鼠血肌酐、尿素氮、尿酸水平。

1.6.2组织病理学观察 肾组织固定后，流水冲洗过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成3 μm厚切片，按试剂说明进行HE染色后，脱水，透明，中性树胶封片。分别于100，200和400倍光学显微镜下观察组织病理形态。参照文献[9]方法对肾小管上皮细胞的损伤情况进行评分，根据萎缩、坏死和炎症细胞浸润的程度分为正常、轻度、中度和重度，并分别记0～3分，最高12分，分数越高损伤程度越重。

1.6.3肾小管上皮细胞凋亡率检测 采用Annexin-V-PI双染法流式细胞技术检测肾小管上皮细胞凋亡情况。取肾小管上皮细胞悬液，加入5 μL的 Annexin-V混匀后避光孵育15 min，后加入10 μL的PI混匀，室温避光反应5 min，加入适量Binding Buffer混匀后上机检测。以早期凋亡细胞数量与晚期凋亡细胞数量计算细胞总体凋亡率。

1.6.4肾小管上皮细胞中NADPH氧化酶活性及ROS水平检测 取肾小管上皮细胞悬液，按照试剂盒说明书，分别采用比色法和ELISA法检测各组肾小管上皮细胞中NADPH氧化酶活性和ROS水平。

1.6.5肾组织中ERK1及其磷酸化水平免疫组化检测 组织切片脱蜡，PBS洗3次，每次5 min；3%过氧化氢封闭15 min；PBS洗3次，每次5 min；10%正常山羊血清封闭30 min；封闭后不洗，加一抗孵育，4 ℃过夜；室温平衡30 min；PBS洗3次，每次5 min；二抗孵育，37 ℃，1 h；PBS洗3次，每次5 min；DAB显色完毕后置于蒸馏水，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察、拍照，采用Image J软件计算ERK1及其磷酸化蛋白阳性区域的面积(每张切片取3个阳性区域进行定量分析，取均值)。

1.6.6肾组织中ERK1及其磷酸化水平Western blot法检测 提取肾组织总蛋白并测定蛋白浓度，根据蛋白marker位置切下目的蛋白所在的PAGE胶；将蛋白转至PVDF膜后，TBS洗膜3次，每次5 min。室温下二抗孵育1 h，化学发光成像仪中显影。目的蛋白与内参照β-actin吸光度值之比为该蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠血尿酸与肾功能比较 各造模组大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮水平均明显高于空白组(P均<0.05)。干预6周后，模型组大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮水平均明显高于空白组(P均<0.05)，别嘌呤醇组和肾康降酸颗粒组大鼠血尿酸、肌酐、尿素氮水平均明显低于模型组及同组造模后(P均<0.05)，且肾康降酸颗粒组均明显低于别嘌呤醇组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血尿酸和肾功能指标水平比较

2.2各组大鼠肾组织形态学比较 HE染色可见模型组大鼠肾小管严重受损，小管上皮细胞变性、坏死、脱落，局部呈裸基底膜样改变，部分视野可见肾小球以及肾小管细胞坏死，间质可见轻重不等的纤维结缔组织增生与炎症细胞浸润，少许肾小管内可见由嗜酸性蛋白形成的蛋白管型，并堵塞肾小管，未坏死区域可见肾小管重度扩张，上皮细胞肿胀与刷状缘脱落，别嘌呤醇组和肾康降酸颗粒组大鼠肾小球与肾小管的损伤较轻，见图1。空白组、模型组、别嘌呤醇组和肾康降酸颗粒组肾小管上皮细胞损伤评分分别为(1.00±0.30)分、(4.30±0.80)分、(3.40±0.80)分和(1.70±0.40)分，模型组明显高于空白组(P<0.05)，别嘌呤醇组和肾康降酸颗粒组均明显低于模型组(P均<0.05)，并且肾康降酸颗粒组明显低于别嘌呤醇组(P<0.05)。

图1 各组大鼠肾组织形态 HE染色表现

2.3各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况比较 空白组、模型组、别嘌呤醇组和肾康降酸颗粒组肾小管上皮细胞凋亡率分别为(4.50±0.34)%、(12.50±1.27)%、(8.02±0.85)%、(6.52±0.47)%， 模型组明显高于空白组(P<0.05)，别嘌呤醇组和肾康降酸颗粒组均明显低于模型组(P均<0.05)，且肾康降酸颗粒组明显低于别嘌呤醇组(P<0.05)。各组流式细胞术检测情况见图2。

图2 流式细胞术检测各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况

2.4各组大鼠肾小管上皮细胞中NADPH氧化酶活性、ROS水平比较 模型组大鼠肾小管上皮细胞中NADPH氧化酶活性和ROS水平均明显高于空白组(P均<0.05),别嘌呤醇组和肾康降酸颗粒组均明显低于模型组(P均<0.05)，且肾康降酸颗粒组均明显低于别嘌呤醇组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肾小管上皮细胞中NADPH氧化酶活性、ROS水平比较

2.5各组大鼠肾组织中ERK1及其磷酸化水平比较 各组大鼠肾组织中ERK1总体表达水平差异均无统计学意义(P均>0.05)；模型组大鼠肾组织中p-ERK1阳性表达面积、p-ERK1相对表达量与p-ERK1/ERK1比值均明显高于空白组(P均<0.05)，别嘌呤醇组和肾康降酸颗粒组上述各指标均明显低于模型组(P均<0.05)，且肾康降酸颗粒组均明显低于别嘌呤醇组(P均<0.05)。见图3、图4和表3、表4。

图3 各组肾组织中p-ERK1与ERK1蛋白表达免疫组化染色表现

图4 各组肾组织中p-ERK1与ERK1蛋白表达灰度图

表3 各组大鼠肾组织中p-ERK1与ERK1阳性表达面积比较

表4 各组大鼠肾组织中p-ERK1与ERK1蛋白相对表达量比较

3 讨 论

高尿酸血症是临床常见的代谢性疾病之一，其发生通常与高嘌呤饮食、过量饮酒、高血压、高血糖、高血脂症以及肥胖等因素密切相关[10]。高尿酸血症不仅可以累及骨和关节引起痛风，此外长期的尿酸代谢紊乱促使尿酸在肾组织中沉积，进而导致肾脏损害[11]。作为临床慢性肾脏疾病发生和进展的独立危险因素，尿酸水平的升高可通过激活氧化应激、炎症反应等途径引起肾损伤[12-13]。故此，降低血尿酸水平对于保护高尿酸血症患者肾脏功能以及延缓高尿酸血症合并慢性肾病患者的病情发展具有重要意义。

通常情况下人体内ROS的清除和产生处于一种动态平衡状态，一旦出现氧化应激反应，组织内氧自由基的产生与清除系统失衡，导致ROS蓄积而引起DNA氧化损伤和蛋白表达异常。越来越多的证据表明，高浓度尿酸可以诱导肾小管上皮细胞发生氧化应激反应，是高尿酸血症导致肾脏损伤的常见原因[14-15]。NADPH氧化酶是促活性氧生成的主要酶类之一，作为ROS产生的最主要来源，其参与机体的多种生理过程[16]。激活的NADPH氧化酶能产生过多活性氧，介导氧化应激损伤。研究发现，高浓度尿酸能够通过上调肾小管上皮细胞内NADPH酶蛋白水平，进而促进氧化应激[17]。ERK信号通路是丝分裂原蛋白激酶(MAPK)中的一个成员，在细胞存活方面发挥重要作用。研究证实ROS可以通过活化ERK信号通路促进炎症反应，诱导细胞损伤[18]。此外，ERK的磷酸化水平也与氧化应激相关，而抑制ERK可以延缓高尿酸血症性肾病的发展[19]。综合以上各项研究结果，提示NADPH/ROS/ERK信号通路与高尿酸血症导致肾损害密切相关。

肾康降酸颗粒是隋淑梅教授在多年的临床和实验研究以及对古籍的整理认识基础上，经过理论确立、药味精心筛选而拟成的经验方，能够有效降低高尿酸血症患者血清尿酸水平和改善患者临床症状[20-21]。该方由12味药组成，其中黄芪、山药益气健脾、补肾固精以治本而共为君药，使脾肾得补而气血得调。姜黄破血除瘀，与大黄共用则祛瘀之功更增；土茯苓利水渗湿解毒，威灵仙祛风通络止痛，二者合力则可使湿浊由小便而去；上四味为臣，以活血化瘀除湿浊而治标。佐使药丹参、牛膝、地龙、泽兰可助臣药活血之力，而白花蛇舌草与薏苡仁可利湿祛浊、清热解毒，以消瘀久化热之虞。全方针对高尿酸血症脾肾两虚、浊毒瘀结之基础病因病机，以“补益脾肾、除湿祛瘀”为法，补虚不留瘀，攻邪而不伤正，可以从根本上延缓高尿酸血症以及高尿酸血症导致的肾脏损伤的发生与发展。

本实验采用腺嘌呤联合酵母粉灌胃制备高尿酸血症大鼠模型进行研究，发现肾康降酸颗粒能够显著降低血尿酸水平，改善高尿酸血症大鼠肾功能，可显著减轻肾组织坏死、炎症细胞浸润，抑制肾小管上皮细胞凋亡，尤其可显著降低肾组织中NADPH氧化酶活性、ROS水平以及ERK1磷酸化水平。提示肾康降酸颗粒可以通过调控NADPH/ROS/ERK信号通路，进而降低高尿酸血症大鼠尿酸水平，减轻肾组织损伤，保护肾小管上皮细胞，进一步为该药的临床应用提供了理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。