NF-κB信号通路在骨性关节炎软骨损伤机制中的研究进展

田明月,彭程云，丁小芬,陈碧敏,周友龙

(1. 河南中医药大学针灸推拿学院，河南 郑州 450046；2. 河南中医药大学国际教育学院，河南 郑州 450046)

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是最常见的关节炎形式，是降低生活质量并造成经济损失及致残的主要原因[1]。当软骨退化关节软骨相互摩擦时，关节损伤就会加剧，导致OA病情的加重。由于人口老龄化和肥胖等因素的影响，OA的患病率将会不断增加[2]。然而，大多数OA的药物治疗，如口服非甾体抗炎药(NSAIDs)和氨基葡萄糖仅限于疼痛管理，而不是预防和治疗，手术通常是治疗OA的最后手段。事实上，目前还没有获得认可和推广的用以改善疾病进展的药物[3]，尽管已经进行了许多使用关节内(IA)给药方法的临床试验，包括使用透明质酸、糖皮质激素、医用臭氧水、针对促炎细胞因子的生物制剂以及使用组织植入物、细胞浓缩物或间充质干细胞的细胞治疗[4]。缺乏针对性治疗疾病的药物，部分归因于对OA发病机制的不完全了解。因此，确定导致OA发生和发展的危险因素可能揭示这种疾病的生物标志物和治疗靶点。

机械应激和促炎细胞因子的升高在破坏关节软骨内稳态中起着重要作用[5]。研究已经确定NF-κB转录因子在OA中异常激活，并且是疾病的致病因子。NF-κB参与到诸多OA的发病环节，包括软骨细胞分解代谢、软骨细胞存活和滑膜炎症。因此，NF-κB及其上游调节因子、辅助因子和下游效应物被认为是OA治疗干预的潜在靶点[6]。本文回顾描述了NF-κB如何参与OA病理生理学和关节软骨内稳态的文献。概述了NF-κB信号转导在OA疾病中的作用，强调其促进软骨分解代谢作用。

1 OA发病机制

慢性机械应力，如关节损伤、超负荷或过度使用等，导致OA中关节软骨、滑膜和软骨下骨的改变，如软骨变性、滑膜炎症、软骨下骨硬化和骨赘形成[7]。关节软骨是关节中特有的的结缔组织，由软骨细胞及其产生的细胞外基质(ECM)组成，关节软骨组织内不仅缺乏血管或神经，而且内在修复能力有限，因此软骨细胞的凋亡在OA进展过程中发挥着至关重要的作用[8]。软骨细胞通过合成ECM来维持软骨的稳态，从而保持软骨的结构和功能的完整性。然而，在OA的病理状态下，软骨细胞失去了保持软骨完整性和自身生存的能力[9]。此外，病变的软骨细胞还可能转化为分泌基质降解酶的分解代谢细胞，分泌基质金属蛋白酶(MMP)和具有凝血酶反应蛋白基序的蛋白聚糖酶(ADAMTS)，其中包括分解代谢所必需的MMP-13和ADAMTS-5[10]。结果细胞外基质的降解和保护失衡，最终导致软骨退化。软骨细胞分解代谢受到各种炎性细胞因子的刺激，包括白细胞介素(IL-1β)，肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-6，这些因子是通过旁分泌或自分泌机制从发炎的滑膜和受损的关节软骨中衍生出来的[11]。被炎性细胞因子、过度机械应力和细胞外基质降解产物等激活的NF-κB不仅诱导靶基因转录，而且还通过正反馈机制刺激炎症介质如IL-1β、TNF-α和IL-6等的分泌[12]。因此，本文的综述重点是它在OA软骨细胞代谢和关节软骨退化中的作用。

2 NF-κB的一般功能和调节作用

NF-κB是一种可诱导的转录因子，在免疫反应、炎症反应、细胞分化以及正常和恶性细胞的生存中居于中心地位。由于NF-κB参与诸多反应，NF-κB信号通路的失调出现在许多疾病过程中，如关节炎、癌症和自身免疫性疾病[13]。在哺乳动物中，NF-κB五个家族成员以同源和异源二聚体的形式组成，包括NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/p52)、RelA(P65)、RelB和c-Rel。在NF-κB二聚体中，p65/p50异源二聚体是最经典的存在形式。它存在于大多数类型的细胞中，并作为一种有效的转录因子，发挥最主要的作用。

在未受刺激的细胞中，NF-κB二聚体通过与抑制性IκB蛋白的结合形成的异三聚体而被滞留在细胞质中。在各种因子刺激下，IκB被IκB激酶磷酸化并被蛋白酶体降解，允许游离的NF-κB复合物转移到细胞核，与NF-κB反应元件结合，并反式激活数以百计的免疫调节蛋白、促炎细胞因子、趋化因子、黏附分子和生长因子的表达[14]。NF-κB还诱导IκBα，后者通过负反馈机制抑制NF-κB。除了动态的亚细胞易位，NF-κB的活性还受其翻译后修饰的调节，如磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化[15]。NF-κB的激活是由两种特征明确的信号通路介导，即经典和非经典信号通路。这些通路分别主要由促炎信号或参与发育的因子激活[16]。经典通路涉及由p65、c-Rel和p50亚基组成的NF-κB二聚体，并需要IKK复合物(IKKα/β/γ)的参与，由于IκB依赖的负反馈机制，该通路是快速作用且可逆的。相反，非经典通路主要通过IKKα激活p52和RelB[16]，与经典通路相比，非经典通路中NF-κB的激活速度更慢，持续时间更长。

3 NF-κB在OA发病中的意义

NF-κB通路是OA刺激(如炎症和机械负荷)激活的主要信号通路之一，通过功能抑制途径证实NF-κB在OA中的意义。在培养的软骨细胞中，用NF-κB抑制剂处理降低IL-1β诱导的分解代谢基因表达[17]。在动物模型中，通过IA注射特异性siRNA[18]，降低了NF-κB p65表达，减轻了膝关节撞击引起的软骨损伤。同时，也观察到滑液中IL-1β和TNF-α浓度的降低。毫不奇怪，IKK作为NF-κB激活机制中上游调节因子，也与软骨细胞分解代谢和软骨退化有关。例如，IA注射BMS-345541，一种选择性IKKα/β抑制剂，不仅在OA手术诱导后2周阻止MMP-13和ADAMTS-5的诱导，而且在8周里减轻软骨损伤[19]。

3.1NF-κB调节软骨细胞分解代谢 了解NF-κB激活对于软骨分解代谢途径的分子机制可能会洞察OA潜在治疗靶点。NF-κB直接或间接诱导MMPs和其他OA相关因子的表达，从而协调异常的软骨分解代谢途径。NF-κB通过位于MMP-1、MMP-9和ADAMTS-5基因启动子中的NF-κB反应元件诱导分解代谢基因表达[20]，以及促进OA中主要促炎细胞因子等破坏性介质的表达，包括环氧合酶-2(COX-2)，前列腺素E2(PGE2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)[21]。特别是iNOS的降低似乎减轻了实验性OA中的软骨破坏。

NF-κB还能够上调其他转录因子，如缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)，ETS结构域包含蛋白-1(ELK1)和E74样因子3(ELF3)，这些因子通过调节炎症和分解代谢介质而使OA疾病慢性化[22]。活化的HIF-2α通过与分解代谢基因启动子中的HIF-2α结合基序结合，促进基质降解酶的表达[23]。此外，CCAAT/增强子结合蛋白-β(C/EBPβ)是一种HIF-2α靶基因，通过直接诱导MMP-13的表达而加剧OA的进展[24]。ELK1直接增加碱性成纤维细胞生长因子处理的软骨细胞中的MMP-13的表达[25]。ELF3作为NF-κB的下游靶标和辅助因子以及NF-κB信号传导的激活剂，驱动如COX-2、iNOS和MMP-13等基因的表达[26]。在一项关于小鼠内侧半月板手术(DMM)诱导的骨关节炎不稳定的研究中，软骨细胞中ELF3的遗传消融改善了OA的发展并抑制了iNOS和MMP-13的表达[27]。OA中软骨细胞肥大样改变在OA的起始和进展中起了一定的作用，NF-κB在软骨细胞肥大中的作用已经被广泛描述[28]。简单地说，NF-κB主要通过SRY-box转录因子-9、骨形态发生蛋白-2和HIF-2α来调节软骨细胞的肥大。例如，HIF-2α不仅是软骨细胞肥大分化所必需的，而且通过与缺氧反应元件结合而有效地诱导MMP-13和血管内皮生长因子的启动子活性[22]。总之，这些研究强调，NF-κB编排基因表达程序，通过协调多层信号网络导致基质降解酶、促炎细胞因子和炎症介质的产生，从而促进OA的发生和发展。

3.2通过直接相互作用调节NF-κB活性的因子NF-κB在软骨细胞中的分解代谢作用由几种NF-κB结合蛋白激活。与NF-κB亚基结合的刺激因子包括IκBζ、转录因子4(TCF4)、核糖核酸结合蛋白(SAM68)和核粘蛋白α2(KPNA2)。与健康软骨相比，OA软骨过度表达这些蛋白质[29]。最近，我们发现IκBζ抑制可能是OA中NF-κB抑制的另一种治疗方法。在软骨细胞中，升高的IκBζ与NF-κBp65、p50和p52亚基响应IL-1β，并显著激活NF-κB依赖的转录反应，包括分解代谢基因[30]。详细的分析显示，软骨细胞中IκBζ的失活减轻了DMM手术引起的软骨破坏，但对滑膜炎症几乎没有影响。因此，IκBζ似乎是NF-κB正确激活OA软骨细胞中基因转录程序所必需的。

TCF4是Wnt信号通路的下游效应器[31]。软骨细胞中TCF4的过度表达通过直接与NF-κBp65结合，诱导MMPs的表达和NF-κB的激活，从而与NF-κB的内源性抑制剂IκBα竞争。SAM68可以调节几种细胞类型中NF-κB的活性[32]。在TNF-α处理的软骨细胞中，SAM68介导NF-κB的激活和分解代谢基因的表达。虽然观察到SAM68和NF-κB p65之间的物理相互作用，但这种结合如何促进NF-κB激活的分子机制尚不清楚。KPNA2是进口蛋白β家族的一员，调节p65核转位。在IL-1β处理的软骨细胞中，KPNA2促进p65核转运，从而加速软骨细胞分解代谢。因此，通过靶向这些因素干扰NF-κB信号传导可能为OA治疗提供了宝贵的机会。

3.3在OA条件下激活NF-κB的因子 研究结果表明，通过多种信号途径增加NF-κB活性与增强软骨破坏呈正相关。例如，将MAPK激酶信号转导至NF-κB激活的MAPK3激酶转化生长因子活化激酶1(TAK1)与OA发病机制有关[33]。IA注射TAK1抑制剂5Z-7导致大鼠DMM模型中NF-κB活化、分解代谢因子表达减少OA发展减慢，IA注射TAK1编码腺病毒引起OA样软骨损伤。越来越多的证据显示OA关节滑液和关节软骨中分泌的蛋白质或肽异常堆积，部分蛋白质可能成为有效的治疗靶点，并起生物标志物的作用。最近，Chang等[34]确定gremlin-1，一种骨形态发生蛋白(BMPs)的细胞外拮抗剂，作为过度机械负荷诱导OA发展的关键调节因子。以前的研究表明，过多的机械负荷会导致NF-κB激活和OA的发展，而生理负荷可以防止软骨丢失，并在多个水平上通过抑制TAK1和IKKβ从而抑制NF-κB的激活[35]。研究者认为，过度机械负荷激活的Rac1-Ros-NF-κB途径诱导Gremlin-1，分泌的Gremlin-1进一步激活NF-κB依赖的软骨细胞分解代谢，而抑制BMPs依赖的软骨细胞的合成代谢。

与脂肪因子功能、能量稳态和脂肪组织炎症相关的细胞外因子在OA病理中也起着关键作用[36]。许多脂肪因子，如瘦素、脂联素、内脂素和抵抗素，对软骨破坏有刺激作用。这些脂肪因子不仅在OA中表达上调，还通过涉及NF-κB的机制诱导软骨细胞中基质降解酶和/或促炎介质的表达。骨桥蛋白(OPN)和骨膜蛋白是参与脂肪组织炎症和骨重塑的分泌因子[37]，也与OA有关。OPN通过激活软骨细胞中的NF-κB来促进MMP-13的表达。然而，也有报道称OPN可以抑制软骨细胞中HIF-2α的表达[38]。此外，OPN 基因敲除小鼠表现出由衰老和不稳定引起的OA进展增强[39]。考虑到这些相互矛盾的发现，可能需要更详细更深入的研究来澄清这些问题。与OPN一样，骨膜蛋白也在人类OA软骨中的表达上调，在人类软骨细胞中用骨膜蛋白处理激活NF-κB依赖的分解代谢基因和炎性细胞因子的表达。

OA滑膜或受损软骨中的炎性细胞因子通过激活NF-κB导致软骨细胞中分解代谢基因表达增加。IL-6，一个众所周知的NF-κB靶基因，也在OA进展中起致病作用[21]。最近，IL-36α、IL-1细胞因子亚家族成员被认为是一种强有力的OA诱导因子[40]，在炎症关节中高度表达。最近，转化生长因子(TGF)-β-IL-36α轴被认为是OA病理中的关键信号通路。在正常关节中，TGF-β信号传导在维持软骨细胞中起保护作用。Li等[41]发现关节损伤引起的TGF-MAPK2型受体(TGFBR2)失活触发IL-36α的诱导，导致NF-κB-MAPK依赖的MMP-13激活，最终导致OA软骨破坏。本研究还揭示了内源性IL-36受体拮抗剂作为潜在的治疗靶点。另一种炎症介质高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种染色质蛋白，具有核因子和细胞外因子的双重功能，也可以激活软骨细胞中的NF-κB信号通路。除了在风湿性关节炎(RA)和OA滑膜中作为炎症介质发挥主要作用外，HMGB1还可以调节IL-1β诱导的NF-κB的激活和软骨细胞中分解代谢基因的表达。

一些药理抑制剂已被证明在OA模型中有效，其中一些通过NF-κB抑制来执行其功能。已报道的抑制剂是蛋白激酶C zeta、嘌呤能P2X7受体(P2X7R)、特异性蛋白1(SP1)和受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)。与药理PKC zeta抑制剂的抗分解作用相似，使用分子途径抑制PKC zeta，如siRNA介导的KD和显性阴性PKC zeta的过度表达，也抑制了炎性细胞因子处理的软骨细胞中ECM的降解[42]。相反，SP1抑制剂普卡霉素A通过主要抑制NF-κB-HIF-2α轴而不是靶向SP1来显示软骨细胞中的抗分解代谢作用，因为SP1KD对IL-1β处理的软骨细胞中分解代谢基因表达的影响最小。总之，这些研究确定了NF-κB抑制的潜在信号通路和靶点。

3.4在OA条件下抑制NF-κB的因子 当NF-κB受到维持软骨内稳态所需的因素抑制时，通常会观察到OA严重程度降低。这些在软骨细胞分解代谢中降低NF-κB活性的抑制因子包括是相关蛋白1(YAP1)、皮质抑素(CST)、胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-2)、Serpin家族E成员2(serpine2)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和细胞因子信号转导-1抑制子(SOCS1)。最近，Deng等[43]确定YAP1是OA中NF-κB活性的关键负性调节因子。从机制上讲，炎性细胞因子诱导河马信号传导激活和依赖于TAK1的YAP1降解，导致IKKα/β-NF-κB级联激活。作者还表明，YAP1的软骨特异性KO通过增强软骨细胞分解代谢来加剧实验性OA。此外，OA的发展通过抑制MST1/2而减轻，MST1/2是河马信号通路中YAP1的上游抑制激酶。CST(一种神经肽)通过直接与肿瘤坏死因子受体结合而拮抗TNF-α功能，从而抑制软骨细胞中NF-κB的激活[44]。对自发和手术诱导的OA模型的研究表明，CST缺乏导致加速的OA样表型，而外源性CST在体内减弱OA的发展。IGF-Ⅱ是一种胰岛素样生长因子，在人类OA软骨中被发现下调[45]。在软骨细胞或小鼠膝关节中过度表达IGF-Ⅱ会降低IL-1β诱导的NF-κB激活或实验性OA进展。Serpine2、LRP1和SOCS1的研究仅限于体外软骨细胞，但这些蛋白被证明负调节炎症细胞因子诱导的NF-κB的激活和软骨细胞中分解代谢因子的表达[46]。这些抑制因子可能有助于减轻NF-κB激活导致的软骨破坏。

4 NF-κB调控的软骨细胞凋亡

由于软骨细胞是唯一存在于软骨中的细胞类型，因此软骨细胞存活的失调可能导致细胞外基质丢失和软骨破坏。许多研究已经证明了软骨细胞凋亡与OA严重程度的相关性。虽然目前尚不清楚软骨细胞凋亡是软骨变性的诱导者还是软骨破坏的副产物，但软骨细胞凋亡是OA发病机制的一个重要方面。NF-κB在软骨细胞存活和凋亡中具有双相作用。NF-κB可以防止TNF-α诱导的细胞死亡，并且这种作用与抗凋亡基因的诱导有关。在软骨细胞中，TNF-α诱导的凋亡也通过NF-κB抑制而减少。相反，NF-κB也可能具有促凋亡的功能，这取决于刺激和细胞环境。激活NF-κB的几个因子，如TCF4、SAM68和RIPK1[47]，被发现增强诱导的软骨细胞的凋亡。此外，HIF-2α作为一种NF-κB靶基因，可加速OA软骨中Fas介导的软骨细胞凋亡。靶向NF-κBp50亚基的MIR-9促进软骨细胞存活。Ding 等[48]还发现miR-93通过靶向TLR4抑制NF-κB途径，可以抑制脂多糖处理的初级软骨细胞和内侧半月板切除撕裂手术模型中的软骨细胞凋亡。

通过使用软骨特异性p65KO模型成年小鼠,Kobayashi等[49]研究显示软骨细胞中p65水平决定软骨是经历内稳态还是破坏。具体地说，成人软骨细胞中p65的杂合KO或低剂量的IKK抑制剂在不影响细胞存活的情况下对OA的发育和软骨细胞的分解代谢都显示出可预测的抑制作用，而使用homo-KO完全抑制p65通过促进软骨细胞凋亡来加速OA。为了支持这一发现，同一小组后来报道，较高剂量的IKK抑制剂并没有缓解OA的发展，而是促进了软骨细胞的凋亡。考虑到这些报道以及NF-κB在许多细胞过程中的作用，例如细胞存活，开发抑制OA-响应性NF-κB信号通路而不是生理p65功能的策略可能很重要。值得注意的是，软骨细胞中IκBζ的同型KO并不影响正常骨骼发育或软骨细胞存活，但显著抑制NF-κB依赖的软骨细胞分解代谢。因此，IκBζ抑制可能是OA中NF-κB抑制的一种有用的治疗方法。

5 结 语

最近许多药物尝试治疗OA相关的疼痛和功能障碍,其中一些药物被证明可以减缓OA的进展，但经常被观察到安慰剂效应和极大的不良反应。使用针对特定基因的生物制剂的临床试验研究侧重于阻断滑膜和关节软骨细胞内的炎症反应，但这种方式在OA治疗中并没有显示出令人满意的效果[50]。NF-κB信号通路为靶向治疗OA提供了多种途径，因为许多引起OA的信号通路都是与NF-κB互连的。因此，在这篇综述中，我们总结了关于NF-κB对OA发病的影响及其在OA软骨中的调控作用。NF-κB与新识别的基因或途径之间的互联可能揭示许多用于减缓或逆转OA进展的药物治疗的潜在靶点。然而，重要的是如何选择性地抑制NF-κB中OA的特异性功能而不是生理反应，这需要进一步研究以避免这种非危及生命的疾病的不良反应。因此，需要更详细地了解NF-κB及其信号通路，以便更好地了解OA的临床特征并进行有效的临床治疗。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。