蒙药梅花草化学成分抗肿瘤活性研究

阿如汗，红 艳，达拉胡，辛 颖

（1. 内蒙古民族大学 蒙医药学院，内蒙古 通辽028000；2. 库伦旗蒙医医院 制剂室，内蒙古 库伦028200）

梅花草（孟根地格达）系虎耳草科梅花草属植物梅花草（Parnassia palustrisLinn.）的干燥全草，具有破痞去滞、抑协日（清除血液中的浊物）和除热解毒等功效，在蒙医临床实践中用于治疗肝血痞、间热痞、内热痞、脉痞、肠协日痞、脏腑协日症等［1-4］.依据蒙医药古籍文献记载，梅花草的首要功效为破痞，破痞属于蒙药功效的一种分类类型，在现代蒙药药理学中破痞被描述为抗肿瘤作用［5］.通过本课题组的前期研究，发现梅花草的石油醚、二氯甲烷萃取部位是其抗肿瘤的活性部位，并从中分离得到11个单体化合物［6-8］.笔者将对梅花草二氯甲烷有效部位中分离的5种单体化合物成分celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein 和4-epi-alyxialactone 开展抗肿瘤活性筛选，旨在为进一步研究蒙药梅花草的破痞药效物质基础提供实验数据.

1 材料与仪器

1.1 原材料 本研究所用的药材样本采集于2015年7月，采集地为内蒙古自治区通辽市扎鲁特旗罕山，经内蒙古民族大学蒙医药学院药用植物学与鉴定学教研室徐都冷教授鉴定为梅花草（Parnassia palustrisLinn.），室内阴干，待用.

1.2 实验细胞株 实验用细胞株（Hela、HepG2）均从上海博谷生物科技有限公司购买.

1.3 实验药物与试剂 化合物celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein、4-epi-alyxialactone 均由实验室自制；胎牛血清（FBS）、细胞培养基（DMEM，高糖）、二甲基亚砜（DMSO，细胞用）、胰蛋白酶（1：250）、双抗（青霉素、链霉素）、MTT等均从美国Gibco公司购买；生理盐水、乙醇、二氯甲烷等分析纯试剂均购自天津科密欧公司.

1.4 实验仪器 TS100型倒置荧光显微镜（日本尼康）；SW-CJ-2F型超净工作台（苏州智净有限公司）；3110 型CO2培养箱（美国Thermo Scientific）；DNM-9602 型酶标仪（北京普朗责任有限公司）；YXQ-LS-100A型立式高压锅（上海博讯有限公司）；DHG-9203A型恒温干燥箱（上海精宏有限公司）；KQ-100型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）.

2 实验方法

2.1 化合物的制备 取约1.5 kg的干燥梅花草全草，使用95%乙醇回流提取，4h/次，共3次.经减压浓缩得梅花草的乙醇提取物.乙醇提取物被水混悬后，依次被石油醚、二氯甲烷萃取得40 g 石油醚萃取物和60 g二氯甲烷萃取物.梅花草的二氯甲烷萃取物经硅胶色谱柱分离，流动相（石油醚：丙酮，v∶v=100∶1→10∶1）梯度洗脱，薄层鉴别后合并斑点相同的流份.其中，流份2（280 mg）经适量石油醚溶解、过滤后，以石油醚-丙酮（v∶v=17∶1）为展开剂，薄层分离鉴别出化合物1（15 mg）和化合物2（11 mg）；流份3（405 mg）经适量二氯甲烷溶解、过滤后，以石油醚-丙酮（v∶v=12∶1）为展开剂，薄层分离鉴别出化合物3（20 mg）、化合物4（14 mg）和化合物5（17 mg）.经13C-NMR、1H-NMR核磁数据鉴定，结合文献报道分析，化合物1～5分别为celahin B（1）、mussaenin A（2）、gardendiol（3）、isoboonein（4）和4-epi-alyxialactone（5）［9-13］.

2.2 抗肿瘤活性实验

2.2.1 细胞培养及给药 Hela、HepG2细胞的培养条件为：含10% FBS的DMEM培养基，5% CO2、37℃的培养环境，培养48～72 h 传代1 次.当肿瘤细胞的生长达到对数生长期时，可对其进行消化、计数和接种（96孔板的接种密度为1.0×105个/mL）.实验分为空白对照组和药物刺激组，加药处理一般选择接种后继续培养的24 h 以后，每组8 个复孔.药物刺激组包括分别加入化合物celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein和4-epi-alyxialactone 的不同浓度（25、50、75、100、200 μg/mL）组，空白对照组加入等体积的不含FBS的DMEM培养基.

2.2.2 MTT 法检测抗肿瘤活性 药物处理24 h可进行细胞活性检测，先吸弃掉细胞培养板中每孔的培养基，加入MTT溶液（1mg/mL）50 μL/孔，培养箱中继续培养4 h，吸掉MTT后加入DMSO（100 μL/孔），酶标仪（490 nm）检测培养板中各实验组的OD值，并计算各化合物对肿瘤细胞增殖的抑制率.抑制率等于空白对照组的平均OD值与药物组平均OD值的差再除以空白对照组的平均OD值的比率.

2.3 统计学方法 数据以均数±标准差表示，各组实验数据的统计学分析通过SPSS17.0软件实现，当P＜0.05，则认为差异具有显著性的统计学意义.

3 实验结果

3.1 celahin B对肿瘤细胞增殖的影响 celahin B在浓度为50～200 μg/mL时，对Hela、HepG2细胞的增殖均有显著的抑制作用，与对照组相比均具有统计学意义.当浓度为75 μg/mL及以上时，对Hela、HepG2细胞的增殖抑制率均大于50%.结果见表1.

表1 celahin B对肿瘤细胞增殖的影响（xˉ±s，n=8）Tab. 1 Effect of celahin B on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.2 mussaenin A 对肿瘤细胞增殖的影响 mussaenin A 在浓度为75～200 μg/mL时，对Hela、HepG2细胞的增殖均有显著的抑制作用，与对照组相比均具有统计学意义.当浓度为100 μg/mL及以上时，抑制率均可达到50%以上.结果见表2.

表2 mussaenin A对肿瘤细胞增殖的影响（xˉ±s，n=8）Tab. 2 Effect of mussaenin A on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.3 gardendiol 对肿瘤细胞增殖的影响 在浓度为100～200 μg/mL 时，gardendiol 对Hela、HepG2 细胞的增殖均有显著的抑制作用，当浓度为200 μg/mL时，对Hela细胞增殖抑制率大于50%.结果见表3.

表3 gardendiol对肿瘤细胞增殖的影响（xˉ±s，n=8）Tab. 3 Effect of gardendiol on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.4 isoboonein 对肿瘤细胞增殖的影响 isoboonein 的浓度为100 μg/mL 及以上时，对Hela、HepG2 细胞的增殖才呈现出抑制活性.结果见表4.

表4 isoboonein对肿瘤细胞增殖的影响（xˉ±s，n=8）Tab. 4 Effect of isoboonein on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.5 4-epi-alyxialactone 对肿瘤细胞增殖的影响 4-epi-alyxialactone 在浓度为50～200 μg/mL 时，对Hela、HepG2细胞的增殖均有显著抑制.当浓度为75 μg/mL及以上时，抑制率大于50%.结果见表5.

表5 4-epi-alyxialactone对肿瘤细胞增殖的影响（xˉ±s，n=8）Tab. 5 Effect of 4-epi-alyxialactone on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

4 讨论

本课题组通过前期工作研究明确了梅花草的抗肿瘤活性，并筛选出其抗肿瘤的活性部位，探讨其促肿瘤细胞凋亡的初步机制［14-16］.同时，利用常规柱色谱法从梅花草的抗肿瘤活性部位-二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物中分离得到11 个单体化合物（celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein、4-epi-alyxialac⁃tone、槲皮素、绿原酸、山奈酚、金丝桃苷、没食子酸和山奈酚-3-O-β-芸香糖苷）.经查阅文献发现，梅花草的化学成分槲皮素、绿原酸、山奈酚、金丝桃苷和没食子酸均有不同程度抗Hela、HepG2细胞增殖的活性，且总体机制与诱导其凋亡相关［17-21］.

本研究通过体外实验研究证实梅花草的化学成分celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein和4-epi-alyxialactone均有不同程度抑制Hela、HepG2细胞增殖的作用，并呈现出浓度依赖性.celahin B、4-epialyxialacton 对Hela 细胞和HepG2 细胞增殖具有很强的抑制活性，当浓度为75 μg/mL 时，抑制率分别为63.73%、63.45%和51.93%、49.69%；当应用celahin B、4-epi-alyxialacton 的最大安全浓度（200 μg/mL）时，抑制率可达72.11%、71.17%和64.63%、59.71%.mussaenin A 浓度为100 μg/mL 时，对Hela、HepG2 细胞增殖的抑制率是56.39%和48.62%.gardendiol 浓度为200 μg/mL 时，对Hela 细胞增殖的抑制率为56.42%.而化合物isoboonein 只有当浓度为200 μg/mL 时，才显示出体外抑制肿瘤细胞增殖的活性，抑制率为43.77% 和34.37%.

综上所述，梅花草中celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein 和4-epi-alyxialactone 等化学成分在体外均呈现出不同程度的抑制肿瘤细胞增殖的作用，该实验结果可为进一步开展蒙药梅花草破痞功效的药效物质基础研究提供参考.