木尼孜其血清对大鼠卵巢早衰颗粒细胞增殖的影响及其机制

迪丽娜孜·艾尔肯，阿尔孜古丽·吐尔逊，玛依热·吐尔洪，夏米西努尔·伊力克

1新疆医科大学基础医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830054；2新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）是指40 岁之前女性即出现卵巢功能不全［1］，主要临床表现为月经停止≥4个月，伴有血清卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平升高，雌二醇（E2）、孕酮（P）水平低［2-3］等。POF 可自发或诱发，诱发 POF 主要有化学疗法和放射疗法、慢性应激、手术（双侧卵巢切除术）等因素［4］。卵巢颗粒细胞（GC）在卵母细胞营养供给和卵巢周期调节中起重要作用，可合成并分泌大量E2、P，分泌在窦前卵泡期和窦卵泡早期发育过程中发挥重要作用的抗苗勒氏激素（AMH）。AMH、E2 及P 对卵泡的发育起负反馈作用，并可通过影响FSH、LH 水平，参与卵泡发育。当化学疗法或其他外部刺激破坏卵巢颗粒细胞时，血清AMH、E2 及 P 水平下降，进一步导致血清 FSH、LH 水平升高，卵泡池耗尽。因此AMH、E2 和P 水平降低及FSH、LH 水平升高可用于评价 POF 严重程度［5］。激素替代疗法（HRT）是目前治疗POF 较为有效的方法［6］，但其不良反应较多。目前临床渐渐用补充和替代药物（CAM）来缓解POF，中药（TCM）在CAM 中的应用是目前的研究热点［7］，目前，亚洲国家已将中草药（CHM）用于POF 的治疗中［8］。研究［9-10］发现，血清药理学比传统药理学在体外直接将生药添加到细胞培养体系中更科学，更适合用于CHM 的干预研究。我们前期研究［11-14］通过制备慢性应激POF 衰动物模型，并通过一系列实验发现木尼孜其对慢性应激所致的POF有改善作用。本研究中，我们从大鼠卵巢中分离卵巢颗粒细胞，并用顺铂制备大鼠POF颗粒细胞，进一步观察不同浓度木尼孜其血清对大鼠POF颗粒细胞的影响，并探讨其可能作用机制，旨在为木尼孜其合剂在临床的应用进一步提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 制备含药血清选用健康SPF 级雌性 SD（Sprague Dawley）大鼠 50 只，体质量（100± 10）g；分离卵巢颗粒细胞选用21～25 日龄健康SPF 级雌性SD 大鼠10 只，体质量（60 ± 10）g。雌性（60 ± 10）g 的幼年SD 大鼠大鼠均由新疆医科大学实验动物中心提供。小茴香7.6 g、铁钱蕨7.6 g、茴芹果7.6 g、甘草11.4 g、红葡萄11.4 g、无花果干22.5 g、玫瑰花（瓣）16.5 g 制成300 mL 木尼孜其合剂。戊酸雌二醇1 ms/片（拜耳医药有限公司，J20171038），成人每日1 mg，折合计算成大鼠所需剂量即0.15 mg/kg。孕马血清促性腺激素（P9970）购自Solarbio公司，胎牛血清（2045512CP）购自美国Gibco公司，DMEM/F-12 培养基（AE29423494）、青霉素（J190007）钩子美国Hyclone公司、链霉素（J190007）、AMH ELISA 试剂盒（E-EL-R3022）、E2 ELISA 试剂盒（E-EL-0152c）、P ELISA 试剂盒 、Epson LX-800 酶联免疫检测仪均购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 木尼孜其血清制备 50 只雌性SD 大鼠适应性喂养1周，将大鼠随机分为5组，每组10只。空白对照组每天灌胃针灌服生理盐水2 mL/次；阳性对照组（戊酸雌二醇组）每天灌服戊酸雌二醇0.15 mg/kg；按本实验所需要的大鼠质量与成人标准体质量（60 kg，应用剂量300 mL/d）折算系数6.3 倍，最终按照成人用药剂量计算大鼠灌胃剂量分别为低（1.8 mL/d）、中（3.6 mL/d）、高（7.2 mL/d）。低、中及高剂量组每只大鼠分别灌服0.9、1.8、3.6 mL/只木尼孜其合剂，2次/天，连续灌胃4 d，第5天早灌入2 次剂量，1 h 取各组大鼠，股动脉采血，离心分离血清-20 ℃备用。将各类血清用含10%胎牛血清的新鲜细胞培养基溶解后备用。

1.3 大鼠POF颗粒细胞制备

1.3.1 大鼠卵巢颗粒细胞分离 取10 只幼年SD大鼠，适应性喂养1 周，腹腔皮下注射PMSG（40 U/只）48 h，水合氯醛麻醉后颈椎脱臼法处死。处死大鼠后用眼科剪将大鼠腹腔呈T 字母型剪开，顺延两侧输卵管找到两个卵巢，分离卵巢，将卵巢周围脂肪（脂肪组织放入预冷PBS 立即呈乳白色固态肉眼可见）等组织分离洗净。冲洗3次，在卵巢组织中加入无血清DMEM/F12 培养基，用生物放大镜确定卵泡位置，用注射器针头刺破卵泡，先刺破一个地方，轻轻推动挤压几次后收集卵泡液，释放卵泡中卵巢颗粒细胞，加入胰酶均匀慢速吹打成细胞悬液，过筛离心，弃上清，收集卵巢颗粒细胞。

1.3.2 大鼠卵巢颗粒细胞鉴定 取“1.3.1”中分离的细胞培养至对数生长期，胰酶消化后加入DMEM/F12 培养液，当细胞长至约80%时，HE 染色后梯度酒精脱水后透明封片，观察细胞形态。卵巢颗粒细胞刚从卵泡中分离释放出时是一个一个的颗粒型，培养24 h 后开始贴壁60%，培养48、72 h 时细胞开始快速增殖，培养4～5 d 时细胞贴壁至90%左右，且较为立体且明显。经HE 染色后镜下可见卵巢颗粒细胞边缘很清晰，多为梭形或多角形，突出的假足相互连接。细胞核大呈现深蓝色，形状为不规则形或者大小不一的卵圆形，细胞液呈淡红色。采用免疫细胞化学（ICC）染色法鉴定卵巢颗粒细胞促卵泡生成素受体（FSHR）表达：取固定好细胞爬片，PBS 冲洗 3 次/10 min，蒸馏水慢速冲洗 3 次，PBS 冲洗3 次/5 min，加入枸橼酸钠95 ℃ 10 min，自然冷却后加入正常山羊血清培养30 min，甩去液体后滴加FSHR 抗体（1：200），4 ℃过夜孵育，PBS 清洗后滴加二抗IgG，37 ℃避光孵育60 min，PBS 清洗梯度脱水透明封片显微镜观察。染色后FSHR 特异表达于卵巢颗粒细胞，细胞质为棕黄色，细胞核为蓝紫色。制备10 张爬片中FSHR 阳性率93.17%＞90%，判定分离细胞为卵巢颗粒细胞，符合后续试验。

1.3.3 大鼠POF 颗粒细胞制备 取大鼠卵巢颗粒细胞悬液铺到96 孔板，每孔100 μL，将细胞随机分为正常组、顺铂模型组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组6个复孔。除正常组外其余5组加入终浓度为5 μg/mL 的顺铂，正常组加入无血清DMEM/F-12培养基，培养48 h备用

1.4 木尼孜其血清给予方法 阳性对照组加入“1.2”中提取含有戊酸雌二醇的血清，低、中、高剂量组分别加入“1.2”中灌服0.9、1.8、3.6 mL木尼孜其血清。

1.5 各组大鼠卵巢颗粒细胞增殖情况观察 分别于培养24、48、72 h，取各组细胞，每孔加入5 mg/mL的MTT 溶液20 μL，37 ℃孵育 4 h，每孔加入DMSO 150 μL，上机读取各孔光密度OD 值。以OD 值代表细胞的增殖情况。重复3次，取平均值。

1.6 各组大鼠卵巢颗粒细胞AMH、E2、P检测 采用ELISA法。培养24 h时取各组细胞培养液，离心分装入冻存管，-20 ℃冻存待用，ELISA法检测细胞培养液AMH、E2、P。所有操作均严格按照使用说明书进行。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间多重比较选择LSD分析（Least significant difference）。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同培养时间各组大鼠卵巢颗粒细胞OD 值比较 培养24、48、72 h 时各组大鼠卵巢颗粒细胞OD值比较见表1。

表1 培养24、48、72 h时各组大鼠卵巢颗粒细胞OD值比较（）

表1 培养24、48、72 h时各组大鼠卵巢颗粒细胞OD值比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，◆P＜0.05；与培养24 h时比较，#P＜0.05。

培养72 h 0.301±0.010 2 0.233±0.026 3*0.404±0.042 1 0.258±0.021 8*0.258±0.021 8*0.413±0.007 2*组 低别OD值剂量组中剂量组高剂量组正常组模型组阳性对照组培养24 h 0.303±0.009 0*0.313±0.009 9*0.392±0.036 6 0.284±0.008 8*0.284±0.008 8*0.310±0.012 6*培养48 h 0.324±0.022 0＃0.433±0.013 3*＃0.396±0.010 9 0.266±0.026 5*＃0.266±0.026 5*＃0.438±0.081 4*＃

2.2 各组大鼠卵巢颗粒细胞培养液AMH、E2、P 水平比较 各组大鼠卵巢颗粒细胞培养液AMH、E2、P水平比较见表2。

3 讨论

中医药治疗中采用血清药理学比在体外直接将生药添加到细胞培养体系中的传统药理学更科学，更适合 CHM 干预研究［15］。本研究中，对雌性 SD 大鼠进行连续四天的灌胃，给药间隔为12 h，因血清收集时间通常在最后 1 次给药 1 h［16-17］，所以本实验中第5 天灌胃1 天总量1 h 即刻进行股动脉釆血，分离血清，目的是在采集样本时保持血液中药物浓度相对稳定并达到峰值［18］。我们用此方法可方便地控制实验条件和排除内部因素的干扰，有助于进一步研究药物的作用机制。本课题组前期研究［11-14］表明，木尼孜其对卵巢早衰大鼠血清中促卵泡生成素、E2、LH 含量有较为明显的改善作用，通过调节血清中这些激素含量，可调整内分泌紊乱等情况，且随着药物剂量的增加改善效果也随之增强。因此我们将卵巢颗粒细胞作为切入点，制备木尼孜其血清干预细胞进一步探讨其改善卵巢衰老的机制，为防治POF提供细胞水平上的研究依据。

表2 各组大鼠卵巢颗粒细胞培养液AMH、E2、P水平比较（）

表2 各组大鼠卵巢颗粒细胞培养液AMH、E2、P水平比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，◆P＜0.05。

组别低剂量组中剂量组高剂量组正常组模型组阳性对照组P（pg/mL）1.120±0.04*1.170±0.08◆1.640±0.05*◆1.280±0.05 1.018±0.03*1.430±0.02*◆AMH（pg/mL）3 237.48 ± 94.64*◆3 420.32±90.87◆3 828.94 ± 23.80*◆3 505.56±36.70 3 042.21±22.08*3 845.86 ± 9.26*◆E2（pg/mL）8.25±0.23*8.47±0.08*11.84±0.29*◆9.78±0.35 7.68±0.22*9.85±0.05◆

本实验研究中我们选择幼年雌性大鼠来进行卵巢颗粒细胞的分离及培养实验，并进行大鼠卵巢颗粒细胞的分离及鉴定［19-20］。此阶段雌性大鼠并没有接触到内源性促性腺激素的刺激，当PMSG 刺激大鼠时，让它在动情早期阶段，产生大量的卵巢颗粒细胞而且处于相同的发育阶段，之后采用机械分离结合胰蛋白酶消化卵巢颗粒细胞，通过两次细胞筛选分离纯化颗粒细胞，这样不仅可以获得更多的细胞，还可减少细胞受损及不相关细胞含量，提高卵巢颗粒细胞的存活率，之后通过HE 染色鉴定卵巢颗粒细胞的形态以及用仅在卵巢中表达的特异性受体促卵泡生成素受体（FSHR）通过免疫细胞化学法对卵巢颗粒细胞进行鉴定［21-22］，用顺铂在体外干预卵巢颗粒细胞，在细胞水平上模拟化疗药物引起的POF中的卵巢颗粒细胞，MTT 法比较不同浓度的木尼孜其血清对顺铂损伤后的卵巢颗粒细胞增殖的影响，MTT 实验结果提示顺铂对卵巢颗粒细胞的增殖有明显的抑制作用；木尼孜其血清可能会促进顺铂损伤后的卵巢颗粒细胞的增殖能力，并且随着浓度的增加其增殖率也明显提升。

卵巢内分泌功能对女性生殖系统的影响是巨大的，女性E2、P的分泌可调节女性体内环境的稳定，控制女性卵巢周期等和生育能力等，卵巢分泌雌激素可以刺激卵泡的发育，释放到血液后可促进或抑制促性腺激素的释放，如FSH、LH 等，从而间接影响卵巢功能。从原始生殖细胞到可受精卵母细胞的分化过程发生在卵巢中的卵泡内［23］，卵巢颗粒细胞作为此过程中的主要细胞，分泌性激素、类固醇和生长因子影响着卵泡的生长［24-26］。当卵巢颗粒细胞受到外界各种类型不良刺激后会影响到其生长及分泌功能，AMH也是由卵巢颗粒细胞分泌，当今随着癌症治疗影响生育能力的背景下，AMH 测定法被用于评估对卵巢有毒性作用治疗后的卵巢储备功能并被认定为卵巢衰老的标志物［27-29］。因此，观察卵巢颗粒细胞在卵巢分泌E2、AMH和P的能力，可以帮助我们了解卵巢分泌功能是否正常，对治疗POF 有指导意义。本研究结果发现，模型组细胞培养液E2、AMH和P水平降低，说明顺铂可抑制颗粒细胞的分泌功能，AMH作为评估可能对卵巢有毒的治疗后的卵巢储备功能的指标［30］，其水平的减少也验证了细胞水平上化疗药物所致POF 模型制备的成功与否；当干预各组含药血清之后水平均升高并且随着时间的增加有浓度也升高，中药木尼孜其高剂量组分泌量显著增加与阳性对照组戊酸雌二醇分泌量相当。说明含木尼孜其的血清可以改善顺铂损伤的卵巢颗粒细胞的分泌功能，通过增加E2、AMH和P的分泌量从而改善卵巢的功能恢复机体的生殖功能。在本课题组前期研究结果中得知［11-14］，用中药木尼孜其进行干预后药物干预组血清中雌激素的水平升高，FSH 和LH 水平降低，卵巢组织的水肿有所改善，同时免疫组化结果提示出现初级卵泡及次级卵泡，颗粒细胞数量增多，闭锁卵泡数量减少，卵泡发育改善，卵巢功能明显提高，所以综合课题组结果认为可能是中药木尼孜其会改善受损的卵巢颗粒细胞中E2、AMH和P分泌量，当E2升高时通过GnRH以正反馈机制触发垂体前叶增加FSH和LH的释放量，并同时增加卵巢颗粒细胞上的FSHR 与LHR，减少血液中FSH 和LH 的水平从而达到各激素的正常水平恢复卵巢的功能。

综上所述，木尼孜其血清可促进POF 的大鼠卵巢颗粒细胞增殖，还可提高卵巢颗粒细胞AMH、E2、P 分泌水平。因此，木尼孜其可能通过促进卵巢颗粒细胞增殖及调节AMH、E2、P 的分泌来达到防治POF 的效果，而其内在调节机制仍需在未来的深入研究中进一步探讨。