大鼠骨髓mMSC和RS细胞肝组织内注射对肝硬化大鼠肝功能及肝脏病变的改善作用观察

谢丽平，林涛发，郭子宽，王少扬

1 中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建福州350001；2 军事医学科学院放射与辐射医学研究所

肝硬化（hepatic cirrhosis）是由不同病因引起的肝脏慢性、弥漫性改变。目前尚无有效内科治疗肝硬化的方法，肝移植是目前临床公认最有效的治疗方法，但移植价格昂贵、肝源匮乏等因素限制了其临床应用。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有低免疫源性、多向分化潜能、取材方便、来源丰富等优势，目前已被广泛用于肝脏疾病的治疗中。MSC 是一个异质性的细胞群体，体外培养可见多数细胞为梭形成纤维细胞和大而扁平细胞，即成熟MSC（mature MSC，mMSC），同时还可观察到一种圆形细胞，其体积很小、颗粒度很低，命名为快速自我更新细胞（rapidly self-renewing cell，RS 细胞），这类细胞具有更强的多向分化能力［1］，认为可能是更原始的干细胞。mMSC、RS 细胞是否可用于肝硬化的治疗中？2020 年2 月—10 月，我们向肝硬化大鼠肝组织内注射mMSC、RS 细胞，比较其抗肝纤维化的效果有无区别，同时体外经HGF 诱导培养后通过RT-PCR 测其ALB、AFP 表达水平，以期进一步探讨RS细胞的肝（样）细胞分化能力。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂 6周龄Wistar雄性大鼠36只，2周龄Wistar 雄性大鼠1 只，均购于解放军军事医学科学院，按实验室标准饲料喂养。Mouse anti-Rat CD31-PE、 CD45-PE、 CD11b/c-PE、 CD86-FITC、CD44-FITC（美国 Becton Dickinson 公司），Human HGF（美国 Peprotech 公司），RNAsimple Total Kit、FastKing One Step RT-PCR Ki（t北京天根生化科技公司），Rat anti-AFP Polyclonal Antibody、Rat anti-ALB Polyclonal Antibody（北京嘉美公司），大鼠源白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）、β-Actin引物均由奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 大鼠骨髓mMSC、RS细胞分离培养及鉴定

1.2.1 大鼠骨髓MSC分离、培养及鉴定 取2周龄Wistar 雄性大鼠1 只，处死后取胫骨和股骨，剪去骨骺端，DMEM 冲出骨髓液，与 PBS 按 1∶1 混匀，200 目尼龙网过滤，收集至50 mL 离心管，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基重悬细胞，105/cm2密度接种于10 mm 培养皿，37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每3天更换一次新鲜培养基，待细胞生长至80%左右传代（6 000/cm2传代）。

将分离培养的细胞按每流式管1×106分装，各管分别加入CD45-PE、CD31-PE、CD11b/c-PE 和CD44-FITC、CD86-FITC，另设1 管阴性对照（无标抗体标记），室温避光 30 min，PBS 洗涤 2 次，流式细胞仪（FACS Calibur，Becton Dickinson）检测。MSC 体外成脂肪和成骨鉴定按本实验室常规方法进行［2-3］。接种24 h 时大鼠骨髓单个核细胞开始贴壁，72 h 见到少量成纤维样细胞（呈长梭形）及很小的圆形细胞，培养6 d 后长梭形细胞呈漩涡状生长，圆形细胞增多散布于梭形细胞之间。流式细胞分析结果为，细胞 CD44 表达呈强阳性，CD31、CD11b/c、CD45 和CD86 表达均呈阴性。体外成骨诱导经碱性磷酸酶染色呈阳性，而对照细胞染色阴性；成脂诱导经油红O 染色呈阳性，对照细胞染色阴性。最终鉴定培养细胞为 MSC［6］。

1.2.2 mMSC、RS 细胞分离培养及鉴定 根据文献［1］确定mMSC直径15～50 μm、RS细胞直径7 μm，因此将培养鉴定的细胞通过直径10 μm 滤膜分离RS、mMSC细胞，分别收集于2个无菌试管中。

①采用流式细胞术鉴定MSC 细胞表型。分离出 RS 细胞（直径＜10 μm）通过流式细胞仪鉴定CD34、CD31、CD44、CD45、CD73 等表型。直径＜10 μm 的细胞 CD44、CD73 表达阳性，CD34、CD31、CD45 表达阴性，鉴定为 MSC［5］。②取 mMSC、RS 细胞进行CM-Dil 染色，按105/cm2密度接种于培养皿，加入HGF（20 ng/mL），在37 ℃、5% CO2培养，每3 d更换培养基及补充HGF。因RS 细胞为半贴壁悬浮细胞，遂将正常贴壁细胞经放射后作为滋养层细胞培养。培养14 d 时取细胞进行CM-Dil 染色，结果发现RS细胞是存活细胞，具有细胞活力。

③另取大鼠肝脏细胞、mMSC 及RS 细胞，RTPCR 法检测细胞 ALB、AFP。设计 ALB、AFP、βactin 的 引 物 序 列 ：ALB：5'-AGCACACAAGAGTGAGATCG-3'和 5'-TGTCATCCTTGTGCTGCAGG-3'，323 bp；AFP：5'-AACAGCAGAGTGCTGCAAAC-3'和5'-AGGTTTCGTCCCTCAGAAAG-3'，668 bp；β-actin：5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'和5'-AGGAGCCAGGGCAGTAATC-3'，353 bp。收集mMSC、RS细胞及正常肝组织细胞，采用RNAsimple Total 试剂盒实验操作步骤分离纯化总RNA 并检测其浓度。RTPCR 步骤根据FastKing One Step RT-PCR 试剂盒操作说明进行，总反应体积 50 μL：2×FastKing One Step RT-PCR MasterMix 25 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL，上游特异性引物（10 μmol/L）1.25 μL，下游特异性引物（10 μM）1.25 μL，RNA 模板 10 ng/μg total RNA，RNase-Free ddH2O 补水至 50 μL。扩增条件为：42 ℃逆转录30 min，95 ℃预变性3 min；94 ℃变性 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃5 min。在1.0%琼脂糖凝胶电泳检测和紫外凝胶成像分析。结果显示：肝细胞表达ALB、AFP；未经 HGF 诱导的 mMSC、RS 细胞及经 HGF 诱导的mMSC、RS细胞均不表达ALB、AFP。

1.3 大鼠肝硬化模型制备、mMSC 和RS 细胞注射方法 ①模型制备：取 Wistar 大鼠按文献［4］报道方法建立肝硬化模型，制备肝硬化大鼠模型共计6周。6 周后随机取3 只大鼠，取肝脏组织做病理学检查，可见肝细胞浊肿，少量脂肪变，肝小叶结构模糊不清，有大小不等的假小叶形成。②分组：36 只肝硬化大鼠随机分为A、B、C 三组。A、B 组大鼠乙醚麻醉成功后开腹，肝组织内分别注射mMSC、RS 细胞，注射细胞量5×106，治疗后即刻关腹缝合；C 组大鼠开腹后注射NS。治疗后三组大鼠继续按建模方案喂养。

1.4 各组大鼠肝功能指标及肝脏病理变化观察分别于治疗前和治疗1、2、4 周时，各组大鼠尾静脉取血1 次（2.5 mL），检测血清谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）。治疗4 周时处死三组大鼠，观察肝脏形态，取肝组织进行病理HE 和Masson 染色，对肝组织进行病理分级评分［5］（包括肝纤维化、肝细胞坏死及脂肪变性评分）。

1.5 统计学方法 采用统计软件SPSS19.0 进行数据处理。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清ALT、TBIL 水平比较 造模成功、治疗1 周、治疗2 周及治疗4 周时各组大鼠血清ALT、TBIL 水平比较见表 1。与 C 组比较，治疗1、2、4 周时 A 及 B 组血清 ALT、TBIL 水平降低（P 均＜0.05）。

表1 造模成功、治疗1周、治疗2周及治疗4周时各组大鼠血清ALT、TBIL水平（）

表1 造模成功、治疗1周、治疗2周及治疗4周时各组大鼠血清ALT、TBIL水平（）

组别A组B组C组n ALT（U/L）TBIL（μmol/L）造模成功350.75±11.58 354.07±11.42 353.00±11.53治疗1周29.83±10.02 25.83± 3.11 328.53±17.25 12 12 12治疗2周45.90±17.10 40.80±23.60 338.00±17.78治疗4周50.17±14.00 40.07±16.11 333.67± 8.02造模成功1.78±0.13 1.79±0.09 1.80±0.06治疗1周0.33±0.15 0.50±0.26 1.80±0.20治疗2周0.30±0.21 0.47±0.21 1.50±0.46治疗4周0.70±0.66 0.80±0.20 1.57±0.25

2.2 各组大鼠肝组织病理评分及病理变化 A 组大鼠肝纤维化、肝细胞坏死、脂肪变性评分分别为（2.42 ± 0.51）、（1.92 ± 0.51）、（1.83 ± 0.39）分，病理评分为（6.25 ± 0.87）分；B 组分别为（2.17 ±0.39）、（1.58 ± 0.51）、（1.75 ± 0.45）及（5.50 ±0.80）分；C 组分别为（3.67 ± 0.49）、（3.17 ± 0.39）、（1.83± 0.58）及（8.75± 1.14）分，与C 组比较，A 及B 组肝纤维化、肝细胞变性坏死评分低（P均＜0.05）。C 组的肝脏假小叶形成，肝细胞水肿变性、坏死（++），见少量脂肪空泡；A、B 组的肝脏假小叶的纤维纤细，肝细胞变性、坏死（+），见少量脂肪空泡（图1）。

图1 治疗4周时各组肝组织病理变化（HE染色，200×）

3 讨论

肝硬化是各种原因导致肝损伤终末期临床表现，肝移植是目前临床治疗肝硬化的唯一手段，但肝源匮乏、费用昂贵及移植后排斥反应等诸多因素限制了其应用。MSC 具有抗肝纤维化的作用，因此MSC可能成为治疗肝纤维化、肝硬化的有效手段。

研究［7］发现，将骨髓MSC（BMSC）细胞移植植入肝硬化大鼠体内，BMSC 细胞归巢至肝脏后，首先分化成肝卵圆细胞，随后分化成肝（样）细胞，并证实BMSC 分化的肝前体细胞可减轻肝纤维化。当肝硬化患者接受MSC 移植治疗后，患者肝功能、终末期肝病模型（MELD）评分及肝脏储备功能分级标准（Child-Pugh）均明显恢复，表明MSC 可改善肝功能及肝纤维化［8］。本研究结果发现，肝硬化大鼠给予mMSC、RS细胞治疗后，血清ALT、TBIL水平均下降，同时病理结果证实大鼠肝坏死及肝纤维化情况均得到改善。

MSC 可通过多个环节抑制肝组织纤维化，一方面MSC 分化为肝细胞或者肝卵圆细胞促进肝脏修复再生［9］，MSC 植入肝脏后，可能与受损的肝细胞融合，或者分化为肝（样）细胞［10-11］。不管是人源还是鼠源MSC 都可以表达肝细胞的某些基因型，因此，MSC 存在分化为肝细胞的潜能［12-13］。另一方面，MSC 通过旁分泌或产生细胞因子等机制抑制肝星状细胞（HSC）的活化，促进HSC凋亡，减少细胞外基质（ECM）的形成［14］。MSC 与HSC 体外共培养时，可分泌某些细胞因子，抑制HSC 的增殖及活性［15］。研究［16］发现，BMSC 可通过干扰 LPS-TLR4 和 NF-κB 信号途径抑制 HSC 的增殖和激活。Cao 等［17］研究发现，BMSC 可以抑制 ACTA2 和 HGF 表达，诱导 HSC凋亡。Kim 等［18］研究发现，MSC 可能通过 HGF 阻断细胞外信号调节激酶的磷酸化作用，使α-SMA 阳性细胞的增殖受到抑制，从而抑制成纤维细胞的生长、增加凋亡，缓解肝纤维化。旁分泌作用的另一机制，MSC 可以通过分泌前列腺素E2 增加IL-10 的分泌，减少TNF-α、IFN-γ和IL-4水平，从而抑制炎症，改善肝纤维化［19-20］。MSC 还可以促进基质金属蛋白酶（MMP）的表达，从而降解EMC 减轻肝纤维化［21］。多数研究者［22-23］认为MSC 抗肝纤维化的机制是多方面机制共同作用的结果，即可能是免疫效应及旁分泌的协同作用，或是肝细胞分化、旁分泌效应、免疫效应三者共同发挥协同作用。

Colter等［1］在培养中发现，MSC多数为梭形成纤维细胞和大而扁平细胞，表面粗糙呈颗粒状，即成熟MSC（mMSC），当MSC在进行极低密度接种时（3/cm2），单细胞克隆群中出现一种小而圆形的细胞，将其命名为RS 细胞，这类细胞体积小、颗粒度低，增殖迅速。RS 细胞表达与mMSC 不同的蛋白和表面抗原，已有研究发现RS细胞表面抗原数表达比mMSC更少，RS细胞表达 CD117、KDR 显著高于 mMSC，表明 RS 细胞是一种更原始的细胞，具有更强的多向分化潜能。Javazon 等［24］通过观察细胞增殖过程，认为RS细胞是mMSC 的前体细胞。当MSC 以3/cm2密度初始接种时，培养2周后细胞扩增可达2 000倍，培养6周增殖可达2×109倍；而当以5 000/cm2高密度接种时，细胞扩增15 倍左右后即停止生长［25］，表明MSC细胞亚群的组成与细胞接种的密度及时间相关，低密度接种可产生更多的RS细胞亚群。

综上所述，肝组织内注射mMSC、RS 细胞的肝硬化大鼠治疗后肝功能及肝纤维化均有改善，表明RS 细胞在改善肝纤维化方面与mMSC 有同样功能。但我们在分离鉴定细胞时发现，mMSC 和RS 细胞体外HGF诱导培养后，RS细胞没有向肝（样）细胞分化的能力。今后应进一步探索RS细胞培养条件，包括细胞接种密度、时间和刺激剂种类，以及细胞输注途径、时机等，寻找更好的细胞亚群提高肝硬化治疗的效果。