10%水杨酸软膏微生物限度检查方法的适用性试验

沈秋莲，叶财发，倪晓霞，陈锦珊

0 引 言

10%水杨酸软膏为《中国人民解放军医疗机构制剂规范》(以下简称《军队制剂规范》)2015年版(第一册)收载的标准制剂[1]，临床用于治疗皮脂溢出、脂溢性皮炎、银屑病、浅部真菌病、趾疣、鸡眼及局部角质增生。《中国药典》2015年版仅收载2%、5%水杨酸软膏，《军队制剂规范》虽然收载有10%水杨酸软膏，但未明确其微生物限度检查的具体方法，经文献查新亦未见相关报道。鉴于10%水杨酸软膏配制过程中容易引入微生物等污染源，因此加强质量控制至关重要。为此，笔者以《中国药典》2015年版四部通则1105、1106及1107检测规则为依据，通过考察供试液的稀释剂、稀释级及pH等因素，同时对10%水杨酸软膏进行处理以消除其抗菌性[2-3]，最终建立微生物限度检查方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器HH-W21-420电热恒温水浴箱(上海医用恒温设备厂)、KQ-500B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)、LDZH-150KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、LRHS-400-Ⅲ恒温恒湿培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)、HWS-400型恒温恒湿培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)、78-1磁力加热搅拌器(金坛市科析仪器有限公司)、PHS-3C酸度计(杭州雷磁有限公司)。

1.1.2 试药水杨酸软膏(批号：201903211、201903212、201903213，规格20 g∶2 g，联勤保障部队第909医院自制)。

1.1.3 稀释液与试剂0.9%氯化钠注射液(批号：20191113，联勤保障部队第909医院自制)，pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：1071461，广东环凯微生物科技有限公司)，肉豆蔻酸异丙酯(批号：201908071，成都艾科达化学试剂有限公司)、二甲基亚砜(批号：180728，浙江杭州双林化工试剂厂)，均为分析纯。

1.1.4 培养基胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：1082461)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号：1081801)、胰酪大豆胨液体培养基(批号：1082451)、沙氏葡萄糖液体培养基(批号：3106032)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号：1082132)、溴代十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号：1073801)，以上均来源于广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.5 菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、铜绿假单胞菌(Pseudomonaaeruginosa )[CMCC(B) 10 104]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63 501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]及黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98 003](以上均来源于中国食品药品检定研究院，且均为3代)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备取经30～35 ℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨液体培养基各1 mL和经20～25 ℃培养2～3 d的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基1 mL，分别用两种稀释剂(0.9%氯化钠注射液和无菌的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液)制成每1 mL含菌数不大于100 cfu的菌悬液[3-6]。

取经20～25 ℃培养5～7 d的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，分别加入3～5 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的两种稀释剂。将孢子洗脱，再用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，分别用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的两种稀释剂制成每1 mL含菌数不大于100 cfu的菌悬液[3-6]。

1.2.2 供试液制备称取供试品20 g，加至含20 mL肉豆蔻酸异丙酯、20 mL二甲基亚砜和玻璃珠的无菌三角烧瓶中，再分别加入0.9%氯化钠注射液和无菌的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至200 mL，振摇，45 ℃水浴超声30 min充分混匀后静置，取水层作为1∶10供试液。从1∶10供试液中取50 mL、20 mL、10 mL，分别加入0.9%氯化钠注射液和无菌的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，充分混匀，作为1∶20、1∶50、1∶100供试液。

1.2.3 微生物计数方法适用性试验(1)以0.9%氯化钠注射液为稀释剂，采用常规法[7-8]进行微生物计数适用性试验：①试验组：取制备好的供试液9.9 mL，加入试验菌菌液0.1 mL，混匀，使每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu，取含菌量不大于100 cfu的供试液1 mL，注入平皿中，立即倾注培养基(需氧菌总数测定用胰酪大豆胨琼脂培养基，霉菌和酵母菌总数测定用沙氏葡萄糖琼脂培养基)，置规定温度培养3～5 d，每个菌株平行制备2个平皿，点计菌落数。②菌液组：用稀释剂代替供试液，按“试验组”的操作加入试验菌液，点计菌落数。③供试品对照组：吸取上述制备好的供试液1 mL，用稀释剂代替菌液，其余操作同“试验组”，测定供试品的本底菌数。 ④阴性对照组：用稀释剂代替供试液和菌液，其余操作同“试验组”，以测定稀释剂的本底菌数。(2)以0.9%氯化钠注射液为稀释剂，采用培养基稀释法[9-10]进行微生物计数适用性试验:试验组：取制备好的供试液9.9 mL，加入试验菌菌液0.1 mL，混匀，使每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu，取含菌量不大于100 cfu的供试液0.2 mL，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，置规定温度培养3～5 d，每个菌株平行制备10个平皿，点计菌落数。供试品对照组、菌液组及阴性对照组同“常规法”操作，测定菌落数，计算回收率。(3)以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂，采用常规法进行微生物计数适用性试验:用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替0.9%氯化钠注射液，试验组、供试品对照组、菌液组及阴性对照组同“常规法”操作。

1.2.4 肉豆蔻酸异丙酯和二甲基亚砜的抗菌性考察按“1.2.2”项下要求制备供试液，分别在含有80 mL0.9%氯化钠注射液和pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液的无菌三角烧瓶中加入10 mL10%肉豆蔻酸异丙酯和10 mL10%二甲基亚砜，振摇混匀，即得1∶10供试液。用上述供试液，采用常规法进行微生物计数方法试验，以5种常用菌作为试验菌用常规法考察肉豆蔻酸异丙酯和二甲基亚砜对抗菌活性的影响。

1.2.5 控制菌方法适用性试验分别取“1.2.2”项下制备好的1∶10供试液10 mL和“1.2.1”项下制备好的金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌菌悬液1 mL(含菌量≤100 cfu)，按《中国药典》2015年版四部金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌检查项下进行试验。

2 结 果

2.1 供试液酸碱度测定结果以0.9%氯化钠注射液为稀释剂时，1∶10～1∶100各稀释级供试液pH值在2.30～2.81之间。以pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂时，1∶10～1∶100各稀释级供试液pH值在5.53～6.88之间。见表1。

表1 两种稀释剂下各稀释级供试液的pH值

2.2 微生物计数方法适用性试验结果以0.9%氯化钠注射液为稀释剂时，分别取1∶10～1∶100供试液，采用常规法和培养基稀释法对水杨酸软膏进行微生物计数方法试验显示，5种试验菌种的回收率均低于0.5，不符合《中国药典》2015年版四部通则要求, 见表2、表3。pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂常规法试验显示，5种试验菌种的回收率均在0.5～2.0范围内，符合《中国药典》2015年版四部通则的要求，见表4。故以pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂，取1∶10供试液1 mL，采用常规法可作为水杨酸软膏的微生物计数方法。

表2 0.9%氯化钠注射液为稀释剂常规法试验回收率(n=3)

2.3 肉豆蔻酸异丙酯和二甲基亚砜的抗菌性考察结果5种试验菌种的回收率均在0.5～2.0范围内，符合《中国药典》2015年版四部通则的要求。故可以用10%肉豆蔻酸异丙酯和10%二甲基亚砜作为增溶剂。见表5。

表3 0.9%氯化钠注射液为稀释剂培养基稀释法试验回收率(n=3)

表4 pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂常规法试验结果(1∶10供试液，n=3)

表5 肉豆蔻酸异丙酯和二甲基亚砜在两种稀释剂下的试验回收率(n=3)

2.4 控制菌方法适用性试验结果以0.9%氯化钠注射液为稀释剂时，试验组、供试品对照组及阴性对照组无菌落生长，菌液组有典型菌落生长，表明供试液对控制菌生长有抑制作用。以pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂时，试验组、菌液组有典型菌落生长，供试品对照组及阴性对照组无菌落生长，表明供试液对控制菌生长无抑制作用。因此，根据《中国药典》2015年版四部通则1106控制菌检查要求，宜选用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂，并采用常规法用于控制菌检查。见表6。

表6 控制菌验证结果(n=3)

3 讨 论

3.1 开展本试验研究的必要性现行的《中国药典》和《军队制剂规范》均无10%水杨酸软膏微生物限度检查方法，亦未见相关研究报道，因此进行试验研究及方法学验证对保证其质量具有重要意义。

3.2 供试液制备增溶剂的选择水杨酸软膏由水杨酸、羊毛脂、黄凡士林等配制而成[1]。水杨酸是一种脂溶性的有机酸[11]，具有部分酸的通性，在水中的溶解性较差，而黄凡士林的熔点为45～60 ℃[12]，具有一定的拉丝性，因此供试液制备时必须遴选适宜的增溶剂。经试验，我们采取加入10%肉豆蔻酸异丙酯和10%二甲基亚砜置于45 ℃水浴超声30 min，发现其不但没有影响微生物生长繁殖，还明显提高了水杨酸软膏的溶解性。其中，肉豆蔻酸异丙酯具有良好的溶解、润滑、促透作用，还具有一定的自乳化作用，而二甲基亚砜具有强极性、脂水双亲性及其在液态所处温度范围广等特性，是兼容有机物和无机物的万能溶剂，两者对难溶性或脂溶性药物具有增溶作用[13-14]。

3.3 供试液pH值对抗菌活性的影响pH值与微生物生长代谢密切相关，不同微生物有不同的适宜pH值，可根据需要调节pH值以适应不同微生物生长需求[15]。对好氧微生物而言，pH值维持在5～9最优。前期我们选用0.9%氯化钠注射液为稀释剂时，制备所得1∶10～1∶100供试液pH值在2.30～2.81之间，采用常规法、培养基稀释法5种试验菌株的回收率均低于0.5，推测强酸环境是导致试验菌株不生长的主要原因。后期我们改用具有pH缓冲作用的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂，制备所得1∶10～1∶100供试液pH值在5.53～6.88之间，采用常规法5种试验菌株的回收率均在0.5～2的标准范围内，而且很好地去除了水杨酸软膏的抑菌性。

综上所述，经验证，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释剂，采用常规法可作为10%水杨酸软膏的微生物限度检查方法。