假单胞菌HYS菌株对油菜种子发芽的影响

姜流+刘斌+王瑞+谢志雄

摘要：為了研究假单胞菌HYS菌株及其上清液对油菜种子发芽的作用，采用LB培养假单胞菌HYS菌株，分别用水（CK）、LB和HYS菌液浸种油菜种子或在油菜发芽过程中分别添加这3种液体。结果表明，HYS菌液浸种不影响油菜种子最终的露白和发芽，但显著抑制油菜种子的露白和发芽进程；在油菜发芽过程中添加HYS菌液也会抑制油菜种子的露白进程，同时还抑制油菜种子的发芽和芽苗生长，而LB抑制油菜根的生长。油菜在发芽过程中，头1～2 d感染HYS菌株则显著抑制油菜种子的发芽，且感染时间越早其抑制效果越强，连续感染HYS菌株对油菜种子发芽和芽苗生长的抑制作用更强，且这种抑制作用主要在发芽的头1～3 d发挥作用。将HYS菌液离心过滤除菌，用水倍比稀释LB和上清液后培养油菜种子，发现上清液经100和1 000倍稀释后促进油菜种子的发芽。上述结果表明假单胞菌HYS菌株在油菜种子发芽和早期生长过程中不适宜用其进行生物防治，但适当稀释HYS上清液可促进油菜种子发芽和生长。

关键词：假单胞菌（Pseudomonas sp.）；HYS菌株；油菜（Brassica napus L.）；发芽

中图分类号：S565.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1232-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.009

Effects of Pseudomonas sp. HYS on the Germination of Rapeseed

JIANG Liu1，2，LIU Bin1，WANG Rui1，XIE Zhi-xiong2

（1.No.1 Middle School Affiliated，Central China Normal University，Wuhan 430223，China；

2.College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，China）

Abstract： In order to study the effect of Pseudomonas sp. HYS on the germination of rapeseed，HYS bacteria were cultured in LB medium， and the rape seeds were soaked with water（control）， LB， and HYS culture liquid， respectively. The results showed that soaking seeds with HYS strain did not affect the split number and the number of shoots at last，but inhibited the splitting and shooting progress of rapeseed. HYS strain inhibited the splitting progress of rapeseed，the rape germination and the growth of rape shoot when the rapeseeds were contaminated with HYS strain during germination. LB inhibited the growth of rape root. HYS strain inhibited the rape germination when the rapeseeds were contaminated with HYS strain during germination of 1～2 d，earlier contamination enhanced the inhibition effect；continuous contamination reinforced the inhibition effect. However，the inhibition effect of HYS strain occurred only during 1～3 days of rape germination. Rape seeds were cultivated by diluted LB and supernatant of HYS bacteria liquid that was treated with centrifugal filter，the results showed that 100 times or 1 000 times diluents of HYS supernatant did not affect the split number of rapeseed，but accelerated rape germination and was beneficial to the growth of rape shoot. The results indicated that the Pseudomonas sp. HYS should not be used during the germination and early stage of growth in rape， however， diluted supernatant of HYS culture liquid could be used to accelerate the rape germination and promote the growth of rape shoot.

Key words： Pseudomonas sp.； HYS strain； rapeseed （Brassica napus L.）； germination

假单胞菌HYS是由武汉大学微生物实验室从东湖水域中筛选出的一株高产铁载体菌[1-3]，在相同培养条件下，其铁载体产量是其他假单胞菌的5倍[1，4，5]。铁是微生物所必需的元素，在环境中的溶解度低，假单胞菌的铁载体可结合环境中微量的游离铁离子，通过膜转运至细胞，满足其对铁的需求[5]，假单胞菌的此生理过程可抑制不分泌或分泌低亲和性铁载体菌的生长[6，7]，因此HYS菌株的铁载体使其具备生物防治的前景。

HYS菌株的基因组测序结果表明该菌株不存在对植物致病的分泌系统，其基因组与假单胞菌P. putida KT2440基因组相近[8]，而后者可以适应土壤、水和植物相关环境[9]，因此HYS菌株具有适应植物相关环境的能力。HYS菌株的基因组还含编码氢氰酸和胞外蛋白酶AprA的基因，这两段序列的蛋白产物在假单胞菌CHA0中发挥杀死秀丽隐杆线虫和根结线虫的作用[8]。用假单胞菌HYS菌株喂养秀丽隐杆线虫，发现该菌株可以杀死秀丽隐杆线虫的胚胎和成虫[8]。

总之，菌株HYS具高效吸收铁元素的体系，具有杀死线虫的基因簇，能杀死秀丽隐杆线虫，具有适应植物相关环境的能力，因此具有对植物寄生性线虫进行生物防治的潜能。本研究以油菜为研究对象，研究HYS菌株是否影响油菜的发芽、生长，为利用HYS菌株进行植物的生物防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用试剂购自武汉迪跃创新生物科技有限公司，假单胞菌HYS菌株由武汉大学微生物学系保存，华油杂62油菜种子由华中农业大学油菜工程中心惠赠。

1.2 HYS菌株上清液

将HYS菌液按1∶100（V/V）加入LB培养液，在30 ℃、220 r/min的条件下培养14 h，菌液内HYS菌的浓度约为5.0×109 CFU/mL；菌液在4 ℃、12 000 r/min离心5 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌。

1.3 假单胞菌HYS菌株浸种对油菜种子发芽的影响

按水（CK）浸种、LB浸种、菌液浸种分组，每组3个重复；用培养皿滤纸法[10]进行油菜种子的发芽试验。具体过程如下：选择0.005 g且子粒饱满的油菜种子[11，12]，每20粒种子放入1.5 mL离心管，标记离心管，分别加入300 μL水、LB或菌液浸种12 h，去除浸种液，用蒸馏水冲洗3遍。取直径9 cm培养皿，内垫4层滤纸，加4 mL滅菌水，按标记播20粒种子，再从培养皿边缘加1 mL水。室内空调设置27 ℃发芽，每天补充相同体积的水，记录露白数和发芽数，104 h后测定芽高和根长。

1.4 假单胞菌HYS菌株对油菜种子发芽的影响

按水（CK）、LB和HYS菌液分组，每组3个重复。每培养皿播20粒种子，并在培养皿内均匀加入1 mL水、LB或HYS菌液，之后每天早上分别在各组加入1 mL水、LB或HYS菌液，补充相同体积的水。记录露白数和发芽数，104 h后测定芽高和根长。

1.5 不同时间感染HYS菌株对油菜种子发芽的影响

按照加菌液的时间分为10组，分别为对照（CK，加水）、第四天加菌液（B1）、第三天加菌液（B2）、第二天加菌液（B3）、第一天加菌液（B4）、头1～4 d加菌液（B5）、头1～3 d加菌液（B6）、头1～2 d加菌液（B7）、2～4 d加菌液（B8）和3～4 d加菌液（B9）组，除加菌液时间外，其余时间加水，每组3个重复。每培养皿播20粒种子，在培养皿内均匀加入1 mL水或菌液，之后每天试验组分别在各组中加入1 mL水或菌液，水较少时补充相同体积的水。记录露白数和发芽数，104 h后测定芽高和根长。

1.6 菌液上清对油菜种子发芽的影响

在上述油菜种子发芽过程中，发现用含HYS的菌液处理影响油菜种子发芽，菌液含HYS、LB和HYS分泌物，为区分这3种成分对油菜种子发芽的作用，设计试验检测HYS分泌物的作用效果。用LB培养HYS菌株，12 000 r/min离心，上清液过滤除菌，用水按10、100、1 000和10 000倍稀释LB和上清液，每个处理3个重复。每培养皿播20粒种子，在培养皿内均匀加入1 mL水（CK）、LB、上清液、倍比稀释的LB和上清液，之后每天在各组加入1 mL相同液体，补充相同体积的水。记录露白数和发芽数，104 h后测定芽高和根长。

1.7 性状测定

在发芽8 h后每2 h记录每个培养皿的露白数， 油菜种皮裂开露出白色内容物即判定为露白。待发芽后每4 h记录每个培养皿的发芽数，油菜两片子叶展开即判定为发芽。

1.8 数据处理

所有数据用Excel 2007、SAS 8.1软件进行分析，差异显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 假单胞菌HYS菌液浸种对油菜种子发芽的影响

2.1.1 假单胞菌HYS菌液浸种对油菜种子露白的影响 从表1可以看出，水、LB和HYS菌液浸种处理组最后的露白数没有差异，但发芽16 h和20 h时，水、LB浸种组露白数显著高于HYS菌液浸种组，说明HYS菌液浸种不影响油菜种子最后的露白数，但HYS菌株产生的某种物质会在发芽过程的特定时期显著抑制油菜种子的露白，即浸种液中的HYS菌株显著抑制油菜种子的露白进程。

2.1.2 假单胞菌HYS菌液浸种对油菜种子发芽的影响 从表2可以看出，水、LB和HYS菌液浸种处理组最后的发芽数没有显著差异，但在发芽88 h时，HYS菌液浸种组的发芽数显著低于水、LB浸种组，说明HYS菌液浸种不影响油菜种子最终的发芽数，但在发芽过程的特定时期显著抑制油菜种子的发芽，即浸种液中的HYS菌株显著抑制油菜种子的发芽进程。

2.1.3 假单胞菌HYS菌液浸种对油菜幼苗生长的影响 水、LB和HYS菌液浸种组的油菜芽高和根长没有显著差异，说明浸种液中的HYS菌株不影响油菜种子发芽的芽高和根长。

2.2 假单胞菌HYS菌株对油菜种子发芽的影响

2.2.1 假单胞菌HYS菌株对油菜种子露白的影响 从表3可以看出，水、LB和HYS菌液处理组最后的露白数都没有差异，但在发芽12～16 h，LB处理组露白数较水处理组显著降低，在发芽12～18 h，HYS菌液组露白数显著低于水处理组，说明LB和假单胞菌HYS菌株会在油菜种子发芽的特定时期抑制油菜种子的露白。在发芽16 h时，水处理组露白数最高，显著高于LB处理组，而LB处理组的露白数又显著高于HYS菌液组，说明在油菜种子发芽的特定时期，含假单胞菌HYS菌株的菌液抑制油菜种子的露白，且这种抑制作用不完全是LB的作用造成的，假单胞菌HYS菌株也发挥了重要作用，即假单胞菌HYS菌株显著抑制油菜种子的露白进程。

2.2.2 假单胞菌HYS菌株对油菜种子发芽的影响 从图1可以看出，在整个发芽期间，水处理组发芽数显著高于LB和HYS菌液处理组，说明LB抑制油菜种子的发芽。在油菜种子发芽80 h时，水处理组发芽数最高，显著高于LB处理组，而LB处理组的发芽数又显著高于HYS菌液组，说明在油菜种子发芽的特定时期，含HYS菌株的菌液抑制油菜种子的发芽，且这种抑制作用不完全是LB的作用造成的，HYS菌株也发挥了重要作用。这些结果说明HYS菌株抑制油菜种子的发芽，且这种抑制作用可能是HYS菌株增殖过程中产生的某种物质发挥了重要作用。

2.2.3 假单胞菌HYS菌株对油菜幼苗生长的影响 从图2可以看出，油菜发芽后的芽高由高到低依次为水处理组、LB处理组和HYS菌液组，说明HYS菌液抑制油菜芽的生长，且这种抑制作用不完全是LB造成的，HYS菌株在此过程中发挥了重要的抑制作用。水处理组的根长显著高于LB处理组和HYS菌液组，且后两组的根长差异不明显，说明LB抑制油菜根的生长，假单胞菌HYS菌株可能对油菜的根没有明显作用。

2.3 不同时间感染假单胞菌HYS菌株对油菜发芽的影响

由于HYS菌株抑制油菜种子的露白进程，也抑制油菜种子的发芽和幼苗生长，因此以水处理为对照，在油菜种子发芽过程的不同时期感染假单胞菌HYS菌株，观察HYS菌株对油菜种子发芽的影响，希望能找出HYS菌株最易影响油菜种子发芽的时间点。在本研究发芽环境温度条件下，油菜种子露白只需24 h，因此，本部分试验的水处理组与HYS菌液处理组油菜种子露白结果与“2.2”節假单胞菌HYS菌液对油菜种子发芽的影响相同，故此处不再比较HYS菌液组与对照组的露白数。

2.3.1 不同时间感染假单胞菌HYS菌株对油菜种子发芽的影响 不同时间感染HYS菌株的油菜种子发芽数见表4。从表4可以看出，如果在整个发芽的4 d时间内仅1 d时间感染假单胞菌HYS菌株，则在发芽的88～96 h期间，各处理组的发芽数没有显著差异，但第二天加菌液组发芽数有降低的趋势，第一天加菌液组发芽数则更低。在发芽80 h时，水处理组、第四天加菌液组和第三天加菌液组发芽数没有差异，而这3组发芽数显著高于第二天加菌液组，第二天加菌液组的发芽数又显著高于第一天加菌液组，这说明在油菜种子的发芽过程中，头1～2 d感染HYS菌株都会显著抑制油菜种子的发芽，而且感染时间越早对油菜种子发芽的抑制效果越强。

如果在整个发芽的4 d时间内连续数天感染假单胞菌HYS菌株，则油菜种子发芽数由低到高依次为头1～4 d加菌液组、头1～3 d加菌液组、头1～2 d加菌液组、2～4 d加菌液组、3～4 d加菌液组，且在发芽80 h时，除头1～3 d加菌液组和头1～2 d加菌液组间外，其他组连续感染HYS菌株的油菜种子发芽数的差异都达显著水平，但2～4 d加菌液组和3～4 d加菌液组最终的发芽数与水处理组没有明显差异，这也说明第一天感染HYS菌株对油菜种子发芽的抑制作用最强。在发芽的80～96 h，头1～2 d加菌液组、头1～3 d加菌液组和头1～4 d加菌液组的发芽数都显著低于仅第一天加菌液组，说明连续感染HYS菌株对油菜种子发芽的抑制作用更强。

2.3.2 不同时间感染假单胞菌HYS菌株对油菜幼苗生长的影响 从表5可以看出，全部加HYS菌组的油菜根长都显著短于水处理对照组，这进一步说明LB抑制油菜根的生长。从B1组到B4组的根长数据可以看出，如果在整个发芽的4 d时间内仅1 d时间接触LB，则油菜根长由长到短依次为水处理组、第四天加菌液组、第三天加菌液组、第二天和第一天加菌液组，且各组间差异显著，说明LB抑制油菜根的生长，且在油菜发芽的早期这种抑制作用更强。从B5组到B9组的根长数据可以看出，如果在整个发芽的4 d时间内连续数天添加假胞菌HYS菌液，则油菜根长比仅1 d添加菌液组更短，说明油菜连续接触LB更不利于油菜根的生长，且连续接触LB的时间越长对油菜根生长的抑制作用越强。

从B0到B4组的芽高数据可以看出，第一天加菌液组与水处理对照组的芽高相同，但第二天加菌液组、第三天加菌液组、第四天加菌液组和3～4 d加菌液组芽高显著高于水处理对照组，说明仅1 d接触HYS菌株不会影响油菜芽的生长，相反，由于菌液含LB，LB的营养物质可能还可促进油菜芽的生长。从B5到B8的芽高数据可以看出，头1～4 d加菌液组、头1～2 d加菌液组、头1～3 d加菌液组的芽高都显著低于水处理对照组，说明连续添加假单胞菌HYS菌株抑制油菜芽的生长，且这种抑制作用主要在发芽的头1～3 d发挥作用。

2.4 假单胞菌HYS菌液上清液对油菜发芽的影响

2.4.1 假单胞菌HYS菌液上清液100倍稀释液对油菜发芽的影响 由表6可知，试验开始后12～18 h时，上清液100倍稀释组露白数与水处理组间无显著差异，两者都显著高于LB 100倍稀释液处理组，20 h时，3组处理的露白数没有显著差异，说明HYS菌液上清液经100倍稀释处理不影响油菜种子的露白，但LB经100倍稀释后却抑制油菜种子的露白进程。

由表7可知，发芽64～82 h，上清液100倍稀释组的发芽数高于水处理组，在发芽72 h，上清液100倍稀释液组的发芽数显著高于LB 100倍稀释液组，后者的发芽数又显著高于水处理组，在发芽的86 h之后，3组的发芽数没有显著差异，说明HYS菌株的上清液經100倍稀释可促进油菜种子的发芽进程。

经100倍稀释处理的LB组和上清液组芽苗长度大于水处理组，说明100倍稀释的LB有助于油菜苗生长。

2.4.2 假单胞菌HYS菌液上清液1 000倍稀释液对油菜发芽的影响 由表8可以看出，12～16 h时，上清液1 000倍稀释液组露白数与水处理组差异不显著，两组露白数显著高于LB 1 000倍稀释液组；16 h后，3组的露白数没有差异，这说明HYS菌液上清液经1 000倍稀释处理不影响油菜种子的露白，但稀释1 000倍的LB却抑制油菜种子的露白进程。

由表9可以看出，在发芽60～72 h，上清液1 000倍稀释液组发芽数高于LB 1 000倍稀释液组，后者发芽数又高于水处理组，72 h后各处理组发芽数没有显著差异，这说明HYS的上清液经1 000倍稀释可促进油菜种子的发芽进程。

3 讨论

3.1 假单胞菌HYS菌株浸种对油菜种子发芽的影响

浸种指用清水或各种溶液浸泡植物种子，可以促进种子早发芽，若使用化学药剂或生物菌剂还可抑制或杀死种子的有害寄生菌，从而达到生物防治的目的。种子的萌发是一个从吸水膨胀到萌动，再到发芽的呼吸代谢过程[13]。本研究发现油菜种子浸种后有明显的吸胀现象，所以用HYS菌株对油菜种子进行浸种处理，则水分和菌株代谢产物可能透过种皮作用于油菜种子而影响其发芽。本研究结果表明HYS菌株浸种不影响油菜种子最后的露白和发芽，也不影响油菜的芽和根的生长，但显著抑制油菜种子的露白和发芽进程。说明HYS菌株的代谢产物可能通过浸种方式透过种皮，从而影响油菜种子的露白和发芽进程。

3.2 假单胞菌HYS菌株对油菜种子发芽的影响

假单胞菌广泛存在于土壤、水、动植物和人体内，在农业领域内，有的假单胞菌是植物病原菌[14]，有的则有益于植物生长[15]，也有的通过拮抗或杀死病原菌发挥对植物疾病进行生物防治的作用[16]。本试验用LB培养HYS菌株，在油菜发芽过程中添加菌液，发现菌液严重抑制油菜根的生长，且这种抑制作用是由LB引起的。

本试验在油菜种子发芽过程中用HYS菌株连续处理，发现油菜种子最后都会全部露白，但HYS菌株显著抑制油菜种子的露白进程，也显著抑制油菜种子的发芽和发芽后的芽高，说明油菜种子在发芽过程中可能受HYS菌株代谢产物的影响，且其对发芽的影响作用比用HYS菌株浸种处理的效果更明显。

本试验在油菜种子发芽过程中，在不同时间点用HYS菌株进行处理，发现在发芽的头1～2 d用HYS菌株处理则显著抑制油菜种子的露白和发芽，而且处理时间越早，对油菜种子发芽的抑制效果越严重，若连续用HYS菌株处理则抑制效果还要更强。若在发芽过程中只在某一天接触HYS菌株，则HYS菌株不影响油菜芽的生长，但2 d及以上接触HYS菌株，则会影响油菜芽的生长，而且处理时间越早越容易抑制油菜芽的生长。

这些结果说明油菜种子在发芽过程中如直接接触HYS菌株，则HYS菌株直接或通过其代谢产物抑制油菜种子的露白进程，但若仅接触1 d，则不影响油菜芽的生长。HYS菌株也抑制油菜种子的发芽、发芽后的芽高，且接触时间越早或接触的时间越长，对油菜芽生长的抑制作用越强烈。

3.3 假单胞菌HYS菌液上清稀释液对油菜种子发芽的影响

在油菜种子发芽过程中，发现用含HYS的菌液处理影响油菜种子发芽，菌液含HYS菌株、LB和HYS分泌物，且LB严重影响油菜根的生长，推测LB的渗透压太大灼伤油菜根，但LB的营养应该可以为油菜生长提供营养，故分离HYS上清液，上清液内含LB和HYS分泌的成分，为了排除LB对油菜发芽的影响，采用相同倍比稀释的LB为对照，即将LB和上清液稀释10～10 000倍，进而获得HYS分泌物对油菜发芽的直接作用。结果表明，在排除LB灼伤油菜根和为油菜发芽提供营养的作用后，100倍和1 000倍稀释上清液不影响油菜种子的露白，且促进油菜种子的发芽进程，说明上清液内HYS的分泌物能促进油菜种子的发芽进程。

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