创伤生肌水凝胶对动物皮肤创伤的愈合作用

梁 卫，董国刚，刘 梅，顾 萌，季 敏，吴艮艮，梁 涛

0 引 言

创面愈合是指由于致伤因子的作用造成组织缺失后，局部组织通过再生、修复、重建，进行修补的一系列病理生理过程。可以概括为3个阶段：①炎症反应，溶解、清除坏死组织和渗出物；②结缔组织细胞和血管内皮细胞游动、增殖，形成肉芽组织；③新生结缔组织基质沉积和新生组织改建[1]。在新形势下创伤贴剂的研究为战时的后勤准备提供需要和支撑，提高野战医疗救护队处理战创伤出血的应急能力，最大限度地降低伤残率和死亡率[2-3]。皮肤创伤常用药物有抗生素、固醇类、促成纤维细胞生长类等外用制剂，容易刺激皮肤和引起过敏等不良反应，且价格昂贵。创伤生肌水凝胶是新型自拟外用中药复方凝胶制剂，由灸黄芪、党参、当归、白芍、茯苓、白术、乳香、没药、黄连组成，具有益气养血、祛瘀生肌、清热化湿作用。中药多为天然成分，具有不良反应小，疤痕形成轻，便于取材、生产成本低等优势。本研究实验观察创伤生肌水凝胶外用对机械性皮肤创伤、创伤性溃疡的治疗效果及作用机制，为今后研发治疗皮肤创伤的外用制剂提供可能。

1 材料与方法

1.1 材料SPF级昆明小鼠50只,雌雄各半，体质量18～22 g；SPF级SD大鼠50只，体质量180～220 g，雌雄各半，饲养于南京中医药大学中心动物房(SPF级)，常规饲料喂养，自由饮食饮水，模拟自然光照，光照时间(7:00-19:00)，温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%。购自上海杰思捷实验动物有限公司[实验动物许可证号：SCXK(沪)2013-0006]。创伤生肌水凝胶水提液配制：处方为炙黄芩30 g，党参30 g，当归20，炒白芍30 g，炒白术30g，茯苓30 g，制乳香15 g，制没药15 g，等。将药浸没于水中30 min后加入药物2倍量水煎制1 h，滤过，药渣再煎制30 min，2次药液混合加热浓缩到所需浓度。创伤生肌水凝胶凝胶配制：卡波姆∶水提液质量比为1∶13，先卡波姆加入纯水中溶解，按比例加入上述熬制好的创伤生肌水凝胶水提液，然后加入适量三乙醇胺调pH=7使之成凝胶状，最后加入辅料0.2 mL丙三醇、0.1 g尼泊金乙酯、0.2 mL甘油得到1 g/mL的创伤生肌水凝胶凝胶剂。锦虹创面修复诱导凝胶购自山西康颐健科技有限公司，卡波姆940购自北京索尔比奥科技有限公司，大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫分析试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司，核因子κB(NF-κB)、Smad2、Smad3一抗购自Abcam公司；低温高速离心机(德国 Eppendorf)，酶标仪(上海科华实验系统有限公司)，电泳仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠化学性创伤性溃疡模型制备与给药取小鼠50只，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，用电推子背部脱毛，脱毛的面积1 cm×1 cm,小鼠背部皮下注射稀盐酸(0.05 mol/mL)0.4 mL/只，单点注射， 3 d后小鼠背部皮肤溃疡形成[4]。将造模小鼠随机分为5组,随机分组方法见文献[5]，每组10只。模型组:给予等量的体积(同其他给药组)等渗盐水；基质组：给予卡波姆凝胶基质0.5%；凝胶低剂量组：1 g/mL；凝胶高剂量组：3.5 g/mL；阳性组：锦虹创面修复诱导凝胶，3 g/支。自造模成功次日分别给各组小鼠局部外敷，在溃疡局部均匀敷2～3 mm厚，约0.5 mL/cm2，每天保持溃疡局部与相应药物接触时间6 h，每只小鼠单笼饲养，以免相互添蹭，6 h后以温等渗盐水清洗用药局部；每天敷药1次，连续敷药10 d。

1.2.2 大鼠机械性创伤模型制备与给药SD大鼠50只，用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，剔除其背部毛发,以无菌手术剪在背部脊柱左右对称地剪开，每只大鼠背部开5个直径为0.7 cm的圆形全层皮肤缺损创面，深至皮下[6]。每个圆形创面设置一个剂量组，分为5组，分组同1.2.1。大鼠造模后，以外敷形式将药物涂布在伤口表面约2～3 mm厚，约0.5 mL/cm2。

1.2.3 观察给药后小鼠化学性损伤皮肤溃疡创面愈合率给药第5天处死小鼠，剪下小鼠溃疡创面皮肤，用透明薄膜描记创面面积，与原创面面积比较，计算各组小鼠创面愈合率。

创面愈合率(%)=(原创面面积-现创面面积)/原创面面积×100%

1.2.4 观察给药后大鼠各组皮肤创面愈合率在给药后第1天、第3天、第6天、第9天分别处死大鼠，用透明薄膜描记创面面积，与原创面面积比较，计算各组大鼠创面愈合率。

1.2.5 大鼠皮肤常规病理组织学切片染色在给药后第9天处死各组大鼠，取皮肤创缘及周围0.5 cm左右宽的组织，深达皮下组织，将组织块甲醛固定，常规石蜡包埋后。常规脱水，包埋，切片后作HE染色，光镜观察皮肤及肉芽组织结构改变。

1.2.6 ELISA法检测大鼠皮肤组织细胞因子表达给药第9天，取大鼠伤口部位皮肤组织，用匀浆机制成10%匀浆。ELISA法检测TGF-β1、IL-2、TNF-α的变化。

1.2.7 Western blot法检测NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表达给药第9天，取大鼠皮肤组织，匀浆制备，采用Western印迹的方法，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳。丽春红染色显示凝胶中的蛋白条带后，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上进行NF-κB65、Smad2、Smad3蛋白的检测。一抗(1∶200)和β-actin(1∶1500)，二抗(1∶5000)稀释。采用赛默飞化学发光底物(ECL)化学发光试剂盒，显影定影水洗晾干后，对胶片感光条带进行灰度扫描。应用BIO-RAD图像分析软件对Western 印迹杂交条带进行密度扫描,检测NF-κB、Smad2、Smad3的蛋白表达。

2 结 果

2.1 创伤生肌水凝胶对于小鼠化学性创伤性溃疡愈合率的影响给药第5天后，与基质组[(1.50±0.25)%]比较，凝胶高剂量组和低剂量组愈合率[(1.22±0.18)%、(1.30±0.12)%]差异无统计学意义(P>0.05)；阳性组愈合率[(23.5±0.48)%]显著提高(P<0.05)，表明阳性组用药可促进化学性溃疡伤口愈合。而创伤生肌水凝胶对化学性损伤溃疡无明显治疗作用。

2.2 创伤生肌水凝胶对于大鼠机械性创面愈合率的影响给药第1、3、6、9天，与模型组比较，基质组的愈合率差异无统计学意义(P>0.05)；给药第6天后，与基质组比较，凝胶低剂量组、高剂量组、阳性组创面愈合率均明显提高(P<0.01)；给药第9天后，凝胶低剂量组、高剂量组、阳性组创面愈合率显著提高(P<0.01)；见表1。给药第6和9天，创伤生肌水凝胶各组和阳性组较基质组皮肤创伤修复明显，表明创伤生肌水凝胶能够促进皮肤创伤愈合。

表1 各组大鼠不同时间机械性创面愈合率比较

2.3 创伤生肌水凝胶对大鼠机械性创面皮肤病理组织学影响给药第9天，模型组皮肤各层组织表皮层增厚，但未完全愈合并伴有组织轻度坏死；基质组表皮结构消失，可见渗出，真皮内见增生性反应，局部有充血；凝胶低剂量组皮肤各层组织结构清晰，结缔组织明显，可见肉芽组织；高剂量组真皮层结构尚清晰，可见肉芽组织形成；阳性组皮肤各层组织结构完整清晰，伤口基本愈合接近正常皮肤。见图1。

图1 各组大鼠机械性创面皮肤病理结果(HE ×400)

2.4 ELISA法检测大鼠皮肤组织细胞因子TGF-β1、IL-2、TNF-α表达与模型组比较，基质组TGF-β1、IL-2、TNF-α含量差异无统计学意义(P>0.05)。与基质组比较，凝胶高剂量组、阳性组TGF-β1含量有显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 创伤生肌水凝胶对各组大鼠TGF-β1、IL-2、TNF-α含量的影响

2.5 免疫印迹法检测NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表达给药第9天，与基质组比较，凝胶高剂量组、阳性组的NF-κB的表达明显下降(P<0.05)，而Smad2、Smad3的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

1：模型组；2：基质组；3：凝胶低剂量组:4：凝胶高剂量组:5：阳性组与基质组比较，*P<0.05图2 创伤生肌水凝胶对各组大鼠NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表达的影响

3 讨 论

创伤修复一直是医学领域的研究热点，而皮肤作为人体最大最外部的器官极易遭受创伤，皮肤创面愈合是一系列复杂的连续的生物化学和细胞活动过程。TGF-β在此过程中是调节成纤维细胞功能的主要细胞因子，TGF-β不仅通过促进成纤维细胞趋化,产生胶原纤维和细胞外基质,还可减少胶原酶的合成,增加金属蛋白酶抑制剂的产生,从而减少伤口中的酶解作用,促进伤口愈合[7-8]。NF-κB是炎症相关转录因子,多种炎症因子如IL-6等的启动子区均含有NF-κB的结合位点，创伤生肌水凝胶可能是通过抑制NF-κB信号传导通路,抑制伤口愈合后期炎症生成和组织纤维化，防止瘢痕和疤痕的形成。Smads蛋白可以调节创面愈合，对皮肤组织修复中有作用，目前认为是“修复相关基因”[9-12]。

创伤生肌水凝胶是由炙黄芩、党参、当归、白芍、茯苓、白术、乳香、没药、黄连组成的中药复方凝胶制剂。方中炙黄芩具有清热解毒生肌作用。党参具有补气固表、益气生肌作用，当归、白芍具有补血活血生肌之功效，茯苓、白术具有健脾益气化湿作用，乳香、没药具有活血祛瘀生肌之功效，黄连具有清热解毒生肌作用。诸药合用，全方具有益气养血、活血祛瘀、清热化湿生肌作用。有研究报道，黄芩多糖可促进成纤维细胞的增殖，并且其增殖作用随时间的延长而增强[13]。单用当归可使瘢痕软化缩小，明显减少瘢痕组织中的成纤维细胞数量和胶原含量，减轻瘢痕纤维化程度。当归中的多糖通过对角质形成细胞TGF-β的表达具有显著的调节作用,从而促进成纤维细胞增殖[14]。乳香和没药具有镇痛作用[15]。

本研究采用皮下注射稀盐酸建立小鼠皮肤溃疡模型，创伤生肌水凝胶各剂量组对化学性溃疡愈合率未见改善作用，说明创伤生肌水凝胶对化学性溃疡造成的溃疡效果不好。采用大鼠皮肤机械性损伤模型，实验结果显示：与基质组比较，凝胶低剂量组、高剂量组于给药第6、9天时皮肤创面愈合率较高，同时病理切片报告显示：给药第9天后，凝胶高、低剂量组皮肤各层组织结构清晰，结缔组织明显，可见肉芽组织。ELISA检测细胞因子结果显示：凝胶高剂量组细胞因子TGF-β1含量有显著升高；Western蛋白实验结果显示：创伤生肌水凝胶抑制NF-κB蛋白的表达，对Smads蛋白表达无影响，提示该药对TGF-β1的作用可能不是通过Smads蛋白通路实现的。

综上所述，创伤生肌水凝胶对化学性创伤溃疡无作用，但能够促进机械性创伤愈合。创伤愈合还与调节免疫、神经肽P物质(SP)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)及血小板生长因子(FGF)等细胞因子有关[16-17]。本实验还有待深化，其创伤修复机制有待于进一步研究，以阐明创伤生肌水凝胶与创伤愈合之间的内在机制。