小青龙汤对肺癌大鼠VEGF/VEGFR信号通路的影响研究

李 慧，冷 静，赵 磊

(1. 新疆医科大学第二附属医院, 新疆 乌鲁木齐 830000；2. 新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830000)

肺癌是目前世界上发病率和病死率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。研究表明，肺癌的发生与机体内VEGF/VEGFR信号通路的异常表达有关[1-3]。小青龙汤出自中国古典医学著作《伤寒论》，有解表散寒、温肺化饮之功效，常用于治疗肺部及呼吸道相关疾病。现代研究表明小青龙汤对于肺癌的具有一定的治疗作用，其能够提高患者生活质量,延长生存时间，并能够抑制 H292细胞增殖及炎症因子的释放[4-5]，然而小青龙汤对肺癌的药理作用机制尚不清楚，故本研究通过动物实验进行了探讨，以期为肺癌的临床治疗提供新的参考和依据。

1 实验材料与方法

1.1药物与仪器 小青龙汤购自建嘉制药有限公司，贝伐珠单抗购自上海罗氏制药有限公司；RNA提取试剂盒、RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天公司，VEGF、VEGFR2及GAPDH抗体购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像仪购自伯乐生命医学产品有限公司。

1.2动物 清洁级成年雄性SD大鼠30只，6～8周龄，体质量(180±20)g，购于新疆医科大学动物实验中心，动物合格证号：SYXK(新)2016-0002。动物房温度(22±2)℃，湿度(50±10)%，适应性喂养1周后进行实验。

1.3分组、造模及干预方法 选择6只大鼠作为对照组，其余24只大鼠参照文献[6-7]方法建立肺癌模型。具体方法：使用含10%胎牛血清的RMPI-1640培养液培养Walker-256癌细胞至对数增长期，收集Walker-256细胞，将Walker-256细胞调整为密度1×107个/mL的细胞悬液，然后将细胞悬液按照0.2 mL/只接种到KM小鼠腹腔，1周内出现腹水。使用无菌注射器抽取KM小鼠Walker-256细胞腹水，用生理盐水稀释后，调整细胞密度为0.5×105个/mL，按照0.2 mL/只经SD大鼠尾静脉注射腹水细胞悬液，继续喂养3周后，使用高分辨率数字小动物X射线机对所有大鼠行胸部影像学检查，观察到肺部肿物形成视为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为模型组、小青龙汤组、贝伐珠单抗组、小青龙汤联合贝伐珠单抗组，每组6只，然后小青龙汤组给予小青龙汤10 mL/kg灌胃，贝伐珠单抗组给予贝伐珠单抗2 mg/kg腹腔注射，小青龙汤联合贝伐珠单抗组给予小青龙汤10 mL/kg灌胃和贝伐珠单抗2 mg/kg腹腔注射，模型组及对照组灌胃等量生理盐水，均1次/d，连续28 d，最后一次干预24 h后进行后续实验。

1.4观察指标与方法

1.4.1p16、p21及p53 mRNA表达实时定量PCR检测 颈椎脱臼处死大鼠后，迅速分离大鼠肺组织，取适量肺组织采用RNA提取试剂盒分别提取肺组织的总RNA。将提取的总RNA逆转录成cDNA后，实时定量PCR检测肺组织中p16、p21及p53 mRNA表达情况。p16引物序列：正向引物5’- GGTCGGAGCCCGATTCA-3’， 反向引物5’-ACGGGGTCGGCACAGTT-3’； p21引物序列：正向引物5’- CAGTACTCTCCTCCCCTCA-3’， 反向引物5’- CCCATGCAGGAGCTATTAC-3’； p53引物序列：正向引物5’- GATGACTGCCATGGAGGAGT-3’， 反向引物5’- CTGTCCCAGACTTCAGGAAA-3’； β-actin引物序列：正向引物5’- ACCGCCGTACA-GAAGAAG-3’， 反向引物5’- CCCCACTTTCTTGACCATTG-3’。实时定量PCR结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.4.2肺组织细胞凋亡率流式细胞术检测 取适量大鼠肺组织，剪碎，1% 胰酶消化30 min，反复吹打后，经流式细胞仪分选纯化细胞系，制成细胞悬液，然后加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，再加入5 μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温(20～25 ℃)孵育15 min，然后加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀，室温(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中，用流式细胞仪检测。

1.4.3肺组织病理观察 大鼠断头处死后，迅速分离肺组织，用4 ℃预冷的生理盐水冲洗干净表面血液，用滤纸吸干表面水分后，放入10%中性甲醛中固定24 h后转移至75%的乙醇中，经自动组织脱水机脱水、透明处理，在石蜡包埋机中浸蜡、包埋，进行5 μm切片，水浴展开，捞片，沥干，放恒温箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常规苏木精-伊红染色(HE)染色，置于通风橱，待乙醇彻底干后依次置于二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待载玻片上残留二甲苯挥干后用中性树胶封片，在显微镜下进行观察。

1.4.4大鼠肺组织中VEGF、VEGFR2表达Western blot检测 将大鼠肺组织放入玻璃匀浆器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，置于4 ℃离心机以12 000 r/min离心10 min，用移液枪将上清液移至另一干净离心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混匀后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃储存备用。将冻存的肺组织蛋白液于室温下融化后，采用BCA法测定蛋白浓度，处理好待测样品后，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1 h，经VEGF、VEGFR2及GAPDH抗体(1∶1 000)孵育后，4 ℃过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，PBST清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像后，应用Image J软件进行免疫印迹灰度值分析。

2 结 果

2.1各组大鼠肺组织中p16、p21、p53 mRNA表达情况 模型组大鼠肺组织中p16、p21及p53 mRNA相对表达量均显著高于对照组(P均<0.05)；小青龙汤组、贝伐珠单抗组及小青龙汤联合贝伐珠单抗组大鼠肺组织中p16、p21及p53 mRNA相对表达量均显著低于模型组，且贝伐珠单抗组及小青龙汤联合贝伐珠单抗组均显著低于小青龙汤组，小青龙汤联合贝伐珠单抗组显著低于贝伐珠单抗组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肺组织中p16、p21及p53 mRNA相对表达量比较

2.2各组大鼠肺组织细胞凋亡率 对照组、模型

组、小青龙汤组、贝伐珠单抗组、小青龙汤联合贝伐珠单抗组肺组织细胞凋亡率分别为(8.11±1.52)%，(2.74±1.48)%，(18.87±3.14)%，(29.89±2.91)%，(40.60±2.78)%。模型组细胞凋亡率显著低于对照组(P<0.05)；小青龙汤组、贝伐珠单抗组及小青龙汤联合贝伐珠单抗组细胞凋亡率均显著高于模型组，且贝伐珠单抗组及小青龙汤联合贝伐珠单抗组显著高于小青龙汤组，小青龙汤联合贝伐珠单抗组显著高于贝伐珠单抗组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠肺组织细胞凋亡流式细胞图

2.3各组大鼠肺组织病理学表现 模型组大鼠肺组织细胞排列不整齐，细胞间隙缩小，细胞核增大，染色加深；小青龙汤组、贝伐珠单抗组及小青龙汤联合贝伐珠单抗组大鼠肺组织细胞排列较整齐，细胞核有所缩小，核仁明显，染色较浅。见图2。

图2 各组大鼠肺组织病理学HE染色表现(×400)

2.4各组大鼠肺组织中VEGF、VEGFR2表达水平模型组大鼠肺组织中VEGF、VEGFR2表达水平显著高于对照组(P均<0.05)；小青龙汤组、贝伐珠单抗组及小青龙汤联合贝伐珠单抗组大鼠肺组织中VEGF、VEGFR2表达水平均显著低于模型组，且贝伐珠单抗组及小青龙汤联合贝伐珠单抗组均显著低于小青龙汤组，小青龙汤联合贝伐珠单抗组显著低于贝伐珠单抗组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠肺组织中VEGF、VEGFR2表达情况

3 讨 论

肺癌发病与吸烟、年龄、性别、空气污染、居住环境等因素密切相关[8-10]。目前，已经明确肺癌的发病机制与机体VEGF/VEGFR信号通路相关蛋白的过度激活密切相关[1-3]。VEGF/VEGFR通路是由血管生成所需的蛋白家族构成的信号转导通路，其与机体生长发育、骨骼肌肥大、月经、妊娠和伤口愈合等病理生理过程密切相关，同时VEGF/VEGFR通路的异常激活也会导致新生血管疾病、类风湿关节炎、银屑病等疾病的发生[11-12]。目前已经上市多种抑制VEGF/VEGFR信号通路的药物，其中贝伐珠单抗是目前临床常用的VEGF/VEGFR信号通路抑制剂之一，故本研究选择该药进行对照研究。

p16、p21及p53基因是一组肿瘤抑制基因，在正常细胞中，它们可以通过调控DNA修复等一系列生理过程造成细胞周期停滞，进而诱导细胞凋亡，并能够长期维持基因组和细胞稳定，抑制肿瘤细胞生长及肿瘤组织血管再生。近年来研究发现，在肿瘤细胞中p16、p21及p53基因发生突变，并存在过度表达现象，从而引起细胞周期紊乱，导致肿瘤细胞反馈性无限制增殖，促进了肿瘤疾病的进一步恶化[13-14]。因此，调节肿瘤细胞中p16、p21及p53基因的表达能够通过调控肿瘤细胞的生命周期进而抑制肿瘤细胞的增殖。

小青龙汤传统用来治疗慢性阻塞性肺气肿、支气管哮喘、急性支气管炎、肺炎等疾病，对肺组织及呼吸道具有明显的保护作用。相关实验研究发现，小青龙汤可明显舒张哮喘大鼠的支气管平滑肌，能够抑制大鼠肺组织纤维化，降低肺源性心脏病大鼠的肺动脉高压[15-16]。

本实验研究了小青龙汤对肺癌大鼠的作用及机制，结果显示小青龙汤组、贝伐珠单抗组及小青龙汤联合贝伐珠单抗组大鼠肺组织中p16、p21、p53 mRNA表达量及VEGF、VEGFR表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高，肺组织病理学得到显著改善。提示小青龙汤能够抑制大鼠肺癌组织抗凋亡基因的过度表达，显著促进癌细胞的凋亡，抑制大鼠肺组织进一步恶化，其可能通过抑制VEGF/VEGFR信号通路的过度激活而发挥抗肿瘤作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。