基于骨髓间充质干细胞的增殖表达探讨变应性鼻炎的体质基础

滕 磊，蔡蔚然，柴宇琪，忻耀杰，袁 波

(上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203)

变应性鼻炎是发生在特应性个体的Ⅰ型变态反应,这种“特应性个体”即中医学“体质”的概念。虽然变应性鼻炎可发生于各种不同体质，但寒体最容易引起变应性鼻炎，症状最严重[1]。由于引起变应性鼻炎的多种炎性细胞及细胞因子与症状呈相关表达[1]，且受到骨髓间充质干细胞(MSCs)的分化和免疫调控的影响[2]，说明体质能影响骨髓MSCs的增殖表达。本研究以大鼠遗传性体质模型为基础，在此基础上构建变应性鼻炎模型，探讨骨髓MSCs在不同体质变应性鼻炎中的增殖表达情况。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 6周龄清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(165±55)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。自由进水、常规饲料喂养，室温稳定于20～25 ℃,空气湿度为60%。

1.2实验试剂和设备 卵清蛋白(Ⅴ级，Sigma，美国)；氢氧化铝、PBS磷酸盐缓冲液、抗体稀释液(科夷生物科技有限公司提供)；CD29(ab179471)单克隆抗体和APC- Goat Anti-Rabbit(Ab130805)(Abcam，美国)；CD44-PE(88151)单克隆抗体(CST，美国)；CD45-FITC(561867)单克隆抗体(BD，美国)；Fresco离心机(Thermo，美国)；FACSCalibur流式细胞仪(BD，美国)；Scepter细胞计数器(Millipore，美国)。

1.3遗传性体质模型的建立 参照文献[3]进行建模。将40只SD大鼠按雌雄分别测量肛温，按照肛温高低筛选自然状态下寒、热、常体3种体质的SD大鼠各8只(雌雄各半)作为亲代大鼠，按体质类型及性别分笼饲养。寒体组灌饲黄连解毒汤，热体组灌饲附子理中汤，常体组灌饲生理盐水，进行体质强化。按人与动物等效剂量换算方法折算用药量，人与大鼠药物每公斤体质量剂量比为1∶6。黄连解毒汤成人剂量：黄连9 g、黄芩10 g、黄柏6 g、生栀子10 g；附子理中汤成人剂量：熟附片9 g、党参10 g、炒白术10 g、炙甘草9 g、干姜9 g。调整至灌药量2 mL/(次·d)，连续30 d后，同种体质类型之间的雌雄鼠两两交配，产下的子1代大鼠同亲代大鼠一样，饲养至体质量(165±55)g，分别按照肛温高低，在同种体质中筛选寒、热、常体的同体质大鼠并灌饲以上中药或生理盐水，如此重复亲代大鼠的体质强化和遗传，直至子4代大鼠形成稳定的寒、热、常体的遗传性体质模型，待子4代鼠体质量(165±55)g时实验用。

1.4动物分组 将子4代鼠按体质和是否药物干预分为寒体无干预组、寒体干预组、热体无干预组、热体干预组、常体无干预组、常体干预组，每组24只，雌雄各半。

1.5变应性鼻炎造模方法 ①系统致敏阶段：以20 mg卵清蛋白+30 mg氢氧化铝为免疫佐剂，溶于1 mL 0.9%氯化钠注射液中，腹腔注射，隔日1次，共8次。②鼻腔激发阶段：在完成系统致敏后，每日以50 mg卵清蛋白溶于1 mL 0.9%氯化钠注射液中，制成浓度为5%的溶液，每只大鼠每侧鼻腔50 μL滴鼻激发变态反应，连续10 d。③局部维持阶段：实验阶段无论取材与否，每日鼻腔继续用卵清蛋白激发，以维持变应性鼻炎的发作状态。在末次滴鼻激发后30 min 内，仔细观察大鼠喷嚏、流涕、鼻痒、鼻塞等鼻变态反应症状，并根据动物行为学积分评价标准进行临床评分[4]，喷嚏:1～3个记1分，4～10个记2分，11个以上记3分；鼻涕:流至前鼻孔记1分，超过前鼻孔记2分，涕流满面记3分；鼻痒: 轻擦鼻1～2次记1分，频繁抓挠鼻记2分，挠鼻不止记2分；鼻塞：喘息急促记1分，喘息加重记2分，喘息致死记3分。上述症状评分累计>5分，表示模型成立。

1.6干预方法 变应性鼻炎造模完成后，3个干预组从第2天开始在鼻腔激发后立即灌胃干预，药物与体质造模相反，即寒体干预组和常体干预组喂饲附子理中汤，热体干预组喂饲黄连解毒汤，剂量同前，连续7 d；3个无干预组无治疗措施。每次灌胃2 h后按时间节点取材。

1.7取材及检测方法 变应性鼻炎模型建立当天为第0天，在第0,1,3,7天分别进行症状评分及取材，每次每组6只大鼠，雌雄各半。大鼠拉颈处死后，取完整右侧股骨，洗涤后PBS反复冲洗骨髓腔，经洗涤、离心，去除上清液，分离细胞层做流式细胞技术检测。骨髓MSCs检测方法：分别加入CD44-PE、CD45-FITC、CD29一抗震荡，PBS洗涤重悬后加入APC- Goat Anti-Rabbit二抗孵育，PBS洗涤、震荡、离心后弃上清液，加PBS 400 μL上流式细胞仪检测。将检测到的表面标志物CD29/CD44阳性/CD45阴性的细胞定为骨髓MSCs。

2 结 果

2.1各组大鼠不同时间点临床症状评分比较 实验当天，寒体2组临床症状评分均明显高于热体2组、常体2组(P均<0.05)，常体2组与热体2组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。寒、热、常体无干预组实验第1，3，7天临床症状评分与实验当天比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；寒、热、常体干预组实验第7天临床症状评分均明显低于实验当天(P均<0.05)。见表1。

表1 各组变应性鼻炎大鼠不同时间点临床症状评分比较分)

2.2各组大鼠不同时间点骨髓MSCs增殖表达情况比较 寒体干预组、常体干预组实验第1天、第3天、第7天骨髓MSCs增殖表达量均明显高于同一时间点同体质非干预组(P均<0.05)。热体干预组和非干预组实验第1天骨髓MSCs增殖表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验第3天、第7天热体干预组均明显高于热体非干预组(P均<0.05)。经混合效应模型分析，非干预各组骨髓MSCs表达量(对数转换后)明显低于干预各组(P均<0.05)；不同体质间比较，热体组和常体组间骨髓MSCs表达量(对数转换后)比较差异无统计学意义(P>0.05)；而寒体组骨髓MSCs表达量(对数转换后)明显少于常体组和热体组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组变应性鼻炎大鼠不同时间点骨髓MSCs增殖情况(取对数转换后)

2.3各组大鼠骨髓MSCs增殖趋势 随着时间的推移，寒、热、常体无干预组的骨髓MSCs增殖趋势整体上呈逐渐减少趋势；而寒、热、常体干预组的骨髓MSCs增殖趋势整体上呈先减少后增多趋势。见图1。

图1 各组变应性鼻炎大鼠不同时间点骨髓MSCs增殖趋势图

3 讨 论

中医体质与疾病的相关性是中医体质学的关键科学问题之一。体病相关理论认为，人的体质与疾病的发生、发展和预后存在相关性，表现为体质决定发病与否及发病的倾向性，影响疾病的病机和证候性质，是预测疾病预后的重要依据。通过研究评价和验证体质与疾病的相关性，对于中医病因学和治疗学发展具有重要意义[5]，可为实施“治未病”提供方法、工具及评估体系，有助于个体化诊疗[6]。

变应性鼻炎的病因病机是正气不足，风寒异气侵袭所致，内因主要涉及肺脾气虚及肾阳的不足，是一个与体质相关性的疾病。研究显示，变应性鼻炎的主要体质是阳虚质[7]，阳虚则温煦和气化功能不足，卫外和固密功能不足，导致机体易受外邪的侵袭，如果患者是阳虚质，则应在辨证论治的基础上结合辨体质论治，将温阳之法贯穿治疗的全过程，将有助于提高疗效[8]。笔者以前的实验[9]和本次实验研究均证实，寒体最容易引起变应性鼻炎，发病时症状最严重，而附子理中汤可以有效持续地缓解变应性鼻炎大鼠的局部症状。

骨髓MSCs具有自我复制、多向分化和低免疫原性及免疫调节功能，不仅可以分化替代损伤细胞，还可通过分泌和表达一系列免疫抑制因子，从而影响炎症的进程，达到调控炎症微环境的目的[10]。有研究表明MSCs可用于治疗变应性鼻炎[11]，不过机制不明确，可能是MSCs可促进Treg细胞增殖，纠正Th1/Th2免疫失衡。Th1与Th2细胞间的免疫失衡是变应性鼻炎发病的免疫学基础，两者通过分泌细胞因子相互调节，以维持机体免疫功能的平衡。当机体受到异常抗原刺激时，上述平衡被打破，便会引起异常的免疫应答[12]，且能诱导产生的Treg细胞在MSCs定植消失后可继续控制炎症反应[13-14]。有研究表明，中药联合MSCs治疗可降低肥大细胞分泌的组胺和浆细胞分泌的IgE水平，对变应性鼻炎小鼠模型有较好的治疗作用[15]。从以上研究可知，骨髓MSCs在变应性鼻炎中扮演了促进变应性鼻炎恢复、调节免疫平衡的作用。因此，研究骨髓MSCs增殖在变应性鼻炎中的表达规律就显得尤为重要。

本实验观察了干预和无干预状态下不同体质变应性鼻炎大鼠的骨髓MSCs增殖表达规律，结果表明体质因素和干预因素对骨髓MSCs的增殖都有影响，也说明骨髓MSCs的增殖可以反映体质情况。试验中，寒、热、常体无干预组的骨髓MSCs增殖趋势整体上呈逐渐减少趋势，一开始骨髓MSCs增殖最多的是常体组，热体组次之，寒体组增殖最少，而随着时间的推移，3组的骨髓MSCs量趋于无差异，说明在不干预的情况下，随着病情的持续，骨髓MSCs增殖越来越趋于较低水平，自然状态下机体很难通过调动骨髓MSCs而达到免疫平衡，而干预后各组骨髓MSCs量均有增加。本实验采用体质治疗干预方法，即寒体组和常体组用温阳的附子理中汤，热体组用清热的黄连解毒汤治疗，结果显示附子理中汤能促使常体组、寒体组的骨髓MSCs持续增殖,黄连解毒汤能促使热体组的骨髓MSCs增殖，说明体质治疗能促进骨髓MSCs的增殖。。

综上所述，骨髓MSCs的增殖能反映变应性鼻炎的体质情况，最容易发生变应性鼻炎的寒体(阳虚质)，其骨髓MSCs的增殖最少，而温阳的附子理中汤可以促进寒体变应性鼻炎大鼠的骨髓MSCs增殖，进一步调节其免疫功能，从而达到免疫平衡状态；其他体质治疗也可达到相应的效果。但附子理中汤或黄连解毒汤对BMSCs的增殖是如何介导变应性鼻炎鼻腔黏膜组织的屏障修复和功能恢复的，还需要深入的基础研究。由于MSCs体外扩增迅速，具有低免疫原性和优越的免疫调节能力，研究BMSCs的增殖与体质及中药干预作用的关系无疑具有广阔的临床应用前景。虽然研究仍处于细胞和动物模型试验阶段，但MSCs临床应用将成为细胞疗法的未来方向。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。