基于肠-肝轴探讨茵陈苓桂剂对非酒精性脂肪性肝病大鼠肠黏膜屏障的作用研究

吴 迪,谢春娥,李 峰1，,王允亮,薛晓轩,袁亚利1,,王乾皓1,,焦 瑶1,,李军祥,杨晋翔

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；3. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 首先排除酒精及其他明确损肝因素，与肥胖、胰岛素抵抗、氧化应激、遗传易感等多种因素有关，其临床病理特征表现以肝实质细胞脂肪变性为主，是一种多系统受累的代谢性疾病，如心脑血管疾病、2型糖尿病等疾病的发生发展均与其有关[1]。目前NAFLD已经成为全球常见的慢性肝病，有研究发现我国的发病率为20.09%，随着大家对身体健康的重视，该疾病已经得到大众的密切关注[2-3]。1998年Marshall[4]提出了“肠-肝轴”的概念，肝脏70%的血供来源于门静脉，当肠黏膜屏障受损，肠内细菌、内毒素等通过门静脉进入肝脏，引起炎性因子的释放，促进氧化应激及胰岛素抵抗的发生，损伤肝脏，“肠-肝轴”在这一过程中起重要作用[5-6]。目前，针对肠道黏膜屏障、肠道菌群及代谢产物与NAFLD发病关系的研究已经成为热点话题。本课题组前期临床研究中发现茵陈苓桂剂可以改善非酒精性脂肪性肝炎患者肝功能和减少肝脏脂肪含量[7]，本研究从“肠-肝轴”和肠黏膜屏障功能的角度进一步探讨了茵陈苓桂剂治疗 NAFLD 的作用机制，为中医药防治NAFLD提供更多依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠60只，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0002，饲养于北京中医药大学动物实验中心。

1.2药物 茵陈苓桂剂由茵陈蒿、栀子、大黄、茯苓、桂枝、白术、甘草、绞股蓝、水飞蓟组成，购于北京中医药大学东方医院颗粒药房。多烯磷脂酰胆碱，赛诺菲安万特(北京)制药有限公司，国药准字H20059010。给药剂量根据大鼠与人的体表面积等效剂量比值进行折算。

1.3主要试剂与仪器 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)试剂盒(南京建成)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒(上海酶联)，内毒素(LPS)试剂盒(prospec，ANT-130)，ZO-1抗体 (Santa cruz，SC- 8146)，Occludin 抗体(Abcam，ab31721)，CD14抗体(prospec，ANT-251)，TLR4抗体(Santa cruz，ab13867)；Rm-2235石蜡切片机(德国莱卡公司)，NIKON Eclipse ci显微镜(日本)，全自动生化分析仪(日立，7600)，EG1150H包埋机(德国莱卡公司)，酶标仪(Thermo Scientific)，3K18离心机(sigma)，Multiskan MK3，电泳转印系统(美国BIO-RAD)。

1.4分组、造模及干预 从60只SD大鼠中随机取10只作为对照组，给予普通饲料喂养；其余大鼠给予高脂饲料[78.8%基础饲料、10%蛋黄粉、10%猪油、1%胆固醇、0.2%胆酸钠，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司生产，许可证号：SCXK(京)2015-0015]喂养建立NAFLD模型，喂养8周后随机抽取2只大鼠，肝脏病理学分析证实造模成功后，将大鼠随机分为5组，茵陈苓桂剂高、中、低剂量组及多烯磷脂酰胆碱组各10只，模型组8只。茵陈苓桂剂高、中、低剂量组给予19.6 g/kg、9.8 g/kg、4.9 g/kg茵陈苓桂剂灌胃，多烯磷脂酰胆碱给予0.15 g/kg多烯磷脂酰胆碱灌胃，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水灌胃，均1次/d，连续4周。

1.5标本采集 大鼠干预结束后禁食24 h，腹腔注射麻醉，其中茵陈苓桂剂中剂量组的2只大鼠因不耐受麻醉而死亡。腹主动脉取血，分别离心取血清、血浆，剖腹取出肝脏和回肠末端组织，部分组织置于4%的多聚甲醛液中固定，另外部分-80 ℃冰箱冻存。

1.6观察指标与检测方法

1.6.1组织病理学观察 取肝脏、回肠末端组织，常规脱水、透明、包埋、切片等操作后，进行HE染色并观察组织病理表现。

1.6.2血液学指标检测 用全自动生化分析仪检测血清AST、ALT、TG、TC水平，用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6水平，用鲎试剂盒检测血浆LPS水平，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

1.6.3回肠组织中TLR4及CD14蛋白表达Western blot检测 取回肠组织，剪碎后加入组织蛋白提取试剂，匀浆、离心，取上清蛋白溶液，采用BCA法测定蛋白浓度，取蛋白40 μL 进行SDS-PAGE电泳，采用湿转法将蛋白质转移至PVDF膜上，加入封闭液室温封闭2 h后加入一抗，4 ℃摇床过夜，用TBST洗膜后，加入二抗室温孵育1 h，再次TBST洗膜，最终采用增强化学发光法(ECL) 曝光检测，最后采用凝胶分析软件分析目标，用目的蛋白灰度值与β-肌动蛋白(β-actin)灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。

1.6.4回肠组织中ZO-1、Occludin表达免疫组织化学检测 取回肠组织，常规固定后制成石蜡切片，再经过脱蜡、复水、修复、封闭，加入一抗、二抗，接着进行DAB显色、复染、脱水封片等常规操作后，显微镜下采集图片进行免疫阳性结果的判断，用平均光密度值表示ZO-1、Occludin的表达强度。

2 结 果

2.1各组大鼠肝组织病理学表现比较 对照组大鼠肝组织结构清晰，肝细胞形态未见明显异常，无脂肪变、气球样变、炎细胞浸润及坏死；模型组大鼠肝细胞出现脂肪变、气球样变，有炎细胞浸润和少许点状坏死，可见胞质内圆形空泡，肝小叶结构异常；各给药组大鼠肝小叶结构、肝细胞脂肪变、脂滴空泡、坏死及炎细胞浸润均较模型组有不同程度的改善。见图1。

图1 各组大鼠肝组织HE染色镜下表现(×200)

2.2各组大鼠回肠组织病理学表现比较 对照组大鼠末端回肠组织肠上皮结构完整、排列紧密，未见上皮细胞脱落坏死，黏膜层肠绒毛排列有序，固有层肠腺丰富，杯状细胞较多，无炎细胞浸润；模型组大鼠末端回肠组织可见肠上皮结构不完整，上皮细胞脱落，部分肠绒毛疏松，肠腺、杯状细胞数量减少，结缔组织增生，伴有淋巴细胞浸润；与模型组相比，各给药组大鼠肠上皮结构基本完整，偶有少量上皮细胞脱落，固有层肠腺丰富，杯状细胞增多，炎细胞浸润不同程度减少。见图2。

图2 各组大鼠回肠组织HE染色镜下表现(×200)

2.3各组大鼠血清生化指标比较 模型组大鼠血清 ALT、AST、TC、TG水平均明显高于对照组(P均<0.05)。多烯磷脂酰胆碱组与茵陈苓桂剂高、中剂量组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平和茵陈苓桂剂低剂量组大鼠血清AST、TC水平均明显低于模型组(P均<0.05)；茵陈苓桂剂高剂量组血清AST水平明显低于茵陈苓桂剂中剂量组(P<0.05)，血清ALT、TC、TG水平明显低于茵陈苓桂剂低剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清生化指标水平比较

2.4各组大鼠血清TNF-α、IL-6及血浆LPS水平比较 模型组大鼠血清TNF-α、IL-6及血浆LPS水平均明显高于对照组(P均<0.05)。茵陈苓桂剂高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6及血浆LPS水平和茵陈苓桂剂中剂量组血清IL-6水平均明显低于模型组(P均<0.05)；茵陈苓桂剂高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6及血浆LPS水平与其他给药组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及血浆LPS水平比较

2.5各组大鼠回肠组织中TLR4及CD14蛋白表达情况 模型组大鼠回肠组织中TLR4、CD14蛋白相对表达量均明显高于对照组(P均<0.05)；各给药组大鼠回肠组织中TLR4、CD14蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，但各组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3及表3。

表3 各组大鼠回肠组织中TLR4、CD14蛋白相对表达量比较

A为对照组；B为模型组；C为茵陈苓桂剂高剂量组；D为茵陈苓桂剂中剂量组；E为茵陈苓桂剂低剂量组；F为多烯磷脂酰胆碱组图3 各组大鼠回肠组织中TLR4、CD14蛋白表达情况

2.6各组大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白表达情况 光镜下观察到对照组大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白阳性表达较多，阳性表达染色主要为棕褐色，模型组大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白阳性表达减少，而各给药组ZO-1、Occludin蛋白阳性表达较模型组增多，见图4。模型组大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白表达平均光密度值明显低于对照组(P均<0.05)；茵陈苓桂剂高剂量组大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白表达平均光密度值均明显高于模型组(P均<0.05)，各给药组间ZO-1、Occludin蛋白表达平均光密度值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表4。

表4 各组大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin平均光密度值比较

图4 各组大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白表达免疫组化染色表现(×200)

3 讨 论

NAFLD的发病机制比较复杂，其中肠黏膜屏障功能与该病的关系已经被大家重视。肠内菌群在人体肠道微生态系统中相互依存和制约才能达成生态平衡，与肠道黏膜结合后参与机体物质代谢，肠道正常生理功能和机体免疫也正是依赖这种平衡。肠道和肝脏在结构和功能上具有一定内在联系，具有相同的胚胎学起源-前肠，二者又共同参与机体免疫功能，构筑起牢固的防御系统[8-9]。在肠、肝防御系统中，肠道屏障作为第一道防线阻挡有害物质(细菌、毒素)通过门静脉进入肝脏，肠黏膜内的淋巴细胞还可以游离于两脏参与免疫调节；而肝脏是机体重要的免疫器官，在防御系统中是机体的第二道防线[10-11]。

肠黏膜机械屏障在肠道屏障中极其重要，是由肠道黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成，其中紧密连接发挥着关键作用，主要包括结构蛋白咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudin)家族以及功能蛋白带状闭合蛋白(ZO)家族等，它们共同完成肠黏膜屏障功能，从而阻挡肠内细菌、内毒素、炎症因子等有害物质对肝脏的损害[12]。如果肠肝循环中肠黏膜屏障被打破，会导致肠源性LPS进入血液[13]。有研究发现，NAFLD患者血液中LPS含量明显增加[14]。进入肝脏的LPS超过肝脏清除能力时，便可以通过与细胞膜表面的特异性受体进入肝细胞，直接造成损伤；Toll样受体4(TLR4) 是LPS最主要模式识别受体，LPS/TLR4信号途径在NAFLD的发生发展中发挥了重要作用[15]。LPS首先与脂多糖结合蛋白(LBP)结合, 然后再与KC表面的细胞膜受体CD14结合，形成LPS-LBP-CD14复合物，进而激活TLR4蛋白的表达，此过程产生大量的细胞因子及炎症介质，可放大免疫炎症反应，加重肝脏损伤[16-19]。

中医学将NAFLD归为“癥瘕”“积聚”“肝痞”“胁痛”“痰浊”“肥气”等范畴。“肝病实脾”理论首见于《难经》“见肝之病，则知肝当传之于脾，当先实其脾气，无令受肝之病邪”，张仲景在《金匮要略》也有记载：“见肝之病，知肝传脾，当先实脾。”中医学对于肝脾相互影响早有深刻的认识。现代医学“肠”的功能相当于“脾”，“脾主运化”，“脾为之卫”，维持机体正常的消化、吸收、代谢及抵御外邪的功能。NAFLD病因病机多与外感寒邪、过食肥甘、劳逸失常、情志失调等有关，病位在肝，与脾有关，脾的运化正常有利于肝的疏泄功能发挥，肝脾失调，运化、疏泄失常会导致气、血、水代谢失调[20]。茵陈苓桂剂组成主要来源于《伤寒论》中的苓桂术甘汤和茵陈蒿汤，茵陈蒿、栀子、大黄、茯苓、桂枝、白术、绞股蓝、水飞蓟等共奏温化痰浊、清利湿热、祛除瘀结之效，使脾气健旺，肝胆疏泄正常，恢复气、血、水的正常运化。

本实验研究结果显示，模型组大鼠肝脏和回肠组织可见明显病理损伤，血清ALT、AST、TC、TG、TNF-α、IL-6及血浆LPS水平和回肠组织中TLR4、CD14蛋白相对表达量均较对照组明显增高，回肠组织中ZO-1、Occludin平均光密度值均较对照组明显降低，提示NAFLD大鼠存在肝脏和回肠损伤；多烯磷脂酰胆碱组与茵陈苓桂剂高、中剂量组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平和茵陈苓桂剂低剂量组大鼠血清AST、TC水平均明显低于模型组，且茵陈苓桂剂高剂量组血清AST水平明显低于茵陈苓桂剂中剂量组，血清ALT、TC、TG水平明显低于茵陈苓桂剂低剂量组；茵陈苓桂剂高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6及血浆LPS水平和茵陈苓桂剂中剂量组血清IL-6水平均明显低于模型组；各给药组大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白阳性表达均高于模组组，TLR4、CD14蛋白相对表达量均低于模型组；茵陈苓桂剂高剂量组大鼠回肠组织中ZO-1和Occludin蛋白表达平均光密度值均高于模型组。说明茵陈苓桂剂可以调节NAFLD大鼠脂代谢，通过修复肠道紧密连接，靶向调控LPS/TLR4信号通路的转导，维持正常肠道黏膜屏障功能，阻止肠内炎症因子、内毒素等进入肝脏，提示茵陈苓桂剂治疗NAFLD作用机制与调节肠-肝轴、改善肠道机械免疫屏障有关。

本研究从肠-肝轴理论、肠黏膜屏障功能及中医学“肝病实脾”的角度出发，探讨了茵陈苓桂剂防治NAFLD的作用机制，不仅能体现中医药治疗的特色，还能通过中西医相结合的理论探讨疾病的治疗效果，然而中医药的优势在于多靶点的治疗，所以还需拓展研究思路及视野为茵陈苓桂剂的临床应用提供更多的客观依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。