大豆转录因子GmDof1.5的克隆与非生物胁迫诱导表达

何佳琦，翟 莹，*，张 军，邱 爽，李铭杨，赵 艳，张梅娟，马天意

(1.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔161006; 2.黑龙江省农业科学院 畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔161005)

Dof(DNA-binding one zinc finger)转录因子属于植物中特有的一类转录因子，在植物中以家族形式存在[1]，因其N端含有一个富含Cys残基的单锌指DNA结合域而得名[2]。自从Yanagisawa从玉米中分离第一个Dof转录因子以来[3]，已经从不同植物中鉴定了大量Dof转录因子[4]。Dof转录因子通过Dof结构域可以识别启动子中含有AAAG的DNA核心元件，从而调控靶基因的转录，参与调节植物的光、激素和防御等反应[5]，表明其在植物逆境胁迫响应中具有重要功能[6]。

拟南芥AtDof5.8能够响应干旱和盐胁迫，其过表达可以增加转基因拟南芥对非生物胁迫的抗性[7]。在水稻的30个Dof基因中，仅有3个基因的表达在PEG处理后受到显著抑制，而其他基因的表达则明显上调，表明它们可能正向调控植物的干旱适应性[8]。转录组数据分析结果显示，大多数大白菜、辣椒和小桐子的Dof转录因子可以被高盐和干旱胁迫诱导表达[9-11]。但在小麦的31个Dof转录因子中，多数都被干旱诱导下调表达，表明多数的小麦Dof基因可能负向调控植物的干旱适应性。此外，TaDof5、TaDof17和TaDof19的表达量在热胁迫下显著下调，而TaDof1的表达量则在盐胁迫下显著上调[12]。由此表明，Dof家族转录因子在应对非生物胁迫过程中具有功能多样性。尽管Dof转录因子能够响应非生物胁迫，但其作用机制仍然不十分明确，应用Dof转录因子改良植物的例子也比较少见。

前人发现大豆中存在78个Dof基因，其中，GmDof4和GmDof11通过调控脂肪酸生物合成相关基因的表达调控大豆种子的油脂含量[13-14]。但大部分基因的功能，尤其是它们与非生物胁迫之间的关系尚未明确。本实验对大豆中的1个功能未被鉴定的Dof转录因子进行克隆，并进行非生物胁迫下的诱导表达分析，以期为大豆Dof转录因子在植物抗逆基因工程中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与非生物胁迫处理

本研究所用植物材料为齐齐哈尔地区广泛种植的大豆抗逆品种北豆9号。在Hoagland营养液中水培大豆幼苗。待大豆幼苗第一片三出复叶完全展开时进行非生物胁迫处理。干旱胁迫，将大豆幼苗置于含15% PEG8000的营养液中；高盐胁迫，将大豆幼苗置于含150 mmol·L-1NaCl的营养液中；低温胁迫，将大豆幼苗置于4 ℃培养箱中；高温胁迫，将大豆幼苗置于42 ℃培养箱中。脱落酸(ABA)处理，用含有200 μmol·L-1的ABA溶液喷洒大豆幼苗。分别在胁迫处理的0、1、2、5、10和24 h(其中，高温胁迫下幼苗生长状态不佳，只进行到10 h)，剪取0.1 g第一片三出复叶并迅速置于液氮中，于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于后续总RNA的提取。

1.2 基因克隆

利用大豆转录因子数据库PlantTFDB(http://www.plantgdb.org/GmGDB/)和NCBI数据库(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，搜索大豆Dof转录因子基因，获得一个功能未知的Dof基因mRNA序列。使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取大豆叶片总RNA，使用cDNA反转录试剂盒(Novoprotein)合成第一链cDNA。根据Dof基因ORF序列，使用Primer 5软件设计引物，上游引物5′-ATGGGCGAGGAATCTCAA-3′；下游引物5′-TCAAGACACGCTTTGGTCC-3′，以第一链cDNA为模板扩增目的基因ORF序列。PCR反应程序如下：94 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物跑琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收PCR产物，连接至pMD18-T载体(TaKaRa)，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.3 生物信息学分析

在线软件ExPASy (http://expasy.org/tools/pi_tool.html)预测蛋白的相对分子质量和等电点；在线软件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1)预测蛋白序列的保守结构域与位置；在线软件PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)预测蛋白的亚细胞定位；在线软件NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测蛋白磷酸化位点；用MEGA 5软件构建蛋白系统进化树。

1.4 实时荧光定量RT-PCR

使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取各样本的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和D260/D280值检测提取RNA的质量。使用cDNA反转录试剂盒(Novoprotein)合成第一链cDNA。使用Primer 5软件设计实时荧光定量RT-PCR引物，上游引物5′-TGGATGGGCGTGCCTATGA-3′；下游引物5′-TTGGTCCCTCGCTGCTGAA-3′。以大豆β-Tubulin基因(GenBank登录号：GMU12286)作为内参基因[15]，上游引物5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′；下游引物5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′。使用BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR仪，参数设置如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共循环40次。实时荧光定量PCR反应体系：2×TB Green Premix ExTaqⅡ(TaKaRa) 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL，补水至总体积20 μL。所有处理均做3次重复，采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 GmDof1.5的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术获得一个大豆中功能未知的Dof转录因子基因GmDof1.5(GenBank登录号：XM014767503)(图1)。GmDof1.5位于大豆基因组15号染色体上，含有一个内含子序列。其mRNA编码序列全长540 bp(图2)，编码含有179个氨基酸残基的蛋白质，相对分子质量为20.15 ku，等电点为9.82。GmDof1.5蛋白序列中含有1个59个氨基酸残基组成的Zf-Dof结构域(图2)，由此推测其为Dof转录因子家族成员。磷酸化位点预测分析显示，GmDof1.5蛋白含有12个丝氨酸(Ser)磷酸化位点、6个苏氨酸(Thr)磷酸化位点和3个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点，这些氨基酸可能在维持蛋白的空间结构、活性与信号转导等方面发挥作用。

M，DL 2000相对分子质量标记物；1-2，GmDof1.5 PCR 扩增产物。M， DL 2000 marker; 1-2， PCR product of GmDof1.5.图1 大豆GmDof1.5 PCR扩增Fig.1 PCR amplification of GmDof1.5 from soybean

下划线代表Zf-Dof结构域；黑体代表磷酸化位点；*代表终止密码子。Zf-Dof domain was underlined; Phosphorylation sites were indicated by boldface type; Stop codon was shown in *.图2 GmDof1.5的核苷酸与氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of GmDof1.5

2.2 Dof蛋白系统进化分析

将大豆GmDof1.5蛋白序列与GenBank中已登录的其他15种植物Dof转录因子蛋白序列构建系统进化树，进行系统发育分析。结果如图3所示，大豆GmDof1.5与鸡血藤SsDof4的亲缘关系最近；此外，它们与野生大豆GsDof1.5、鹰嘴豆CaDof4和赤豆VaDof1.5也具有较近的亲缘关系。

2.3 GmDof1.5非生物胁迫诱导表达分析

利用实时荧光定量PCR分别检测了GmDof1.5基因在ABA、干旱、高盐、高温和低温胁迫处理下的表达动态。从图4中可以看出，GmDof1.5对5种非生物胁迫的响应存在差异。干旱处理后(图4-A)，GmDof1.5表达量先升高，在处理10 h时达到最大值，是未处理对照表达量的14倍，之后表达量下降，但仍然高于对照；高盐处理后(图4-B)，GmDof1.5表达量持续升高，在处理24 h时达到最大值，是未处理对照表达量的32倍；高温处理后(图4-C)，GmDof1.5表达量先升高，在处理5 h时达到最大值，是未处理对照表达量的117倍，之后表达量下降，但仍然高于对照；低温处理后(图4-D)，GmDof1.5表达量先下降后升高，在处理5 h时达到最大值，是未处理对照表达量的7倍；ABA处理后(图4-E)，表达量持续升高，在处理24 h时达到最大值，是未处理对照表达量的83倍。由此推测GmDof1.5在大豆中可不同程度地响应非生物胁迫，且对高温胁迫的响应最为明显。

3 讨论

Dof转录因子在植物的生长发育和非生物胁迫响应中起重要的调控作用[16-18]。目前，Dof转录因子的研究多集中于不同植物Dof家族全基因组的预测分析[1，19]，而Dof基因的克隆与抗逆功能研究也主要集中在模式植物拟南芥中[7，17]。关于大豆Dof基因与非生物胁迫关系的研究尚未系统开展。本研究从大豆中克隆了GmDof1.5基因，并对其蛋白结构、理化性质与进化关系等进行预测。蛋白序列和系统进化分析表明，GmDof1.5是一个典型的Dof转录因子家族成员。不同植物中Dof转录因子理论等电点存在差异，但基本处于5.41～6.97，且碱性氨基酸数目普遍高于酸性氨基酸[20]。但GmDof1.5等电点为9.82，偏碱性类型，这与王海波等[21]的研究结果相符，可能意味着GmDof1.5在功能上具有特殊性。Dof蛋白保守结构域侧翼序列对Dof蛋白与DNA的结合存在一定影响[22]，GmDof1.5蛋白序列中含有大量磷酸化位点，推测它们可能通过磷酸化与去磷酸化共价修饰调节GmDof1.5蛋白与DNA顺式作用元件的结合[23]。Dof蛋白系统进化分析表明，大豆GmDof1.5、鸡血藤SsDof4、野生大豆GsDof1.5、鹰嘴豆CaDof4和赤豆VaDof1.5具有较近的亲缘关系，可能与大豆、鸡血藤、野生大豆、鹰嘴豆和赤豆均属于豆科植物相关。

图3 Dof蛋白系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Dof proteins

**和*分别代表在1%和5%概率水平上差异显著。** and * indicate significant difference at P<0.01 and P<0.05， respectively.图4 干旱(A)、高盐(B)、高温(C)、低温(D)和ABA(E)处理下GmDof1.5在大豆幼苗中的表达Fig.4 Expression of GmDof1.5 under drought(A)， salt(B)， high temperature(C)， low temperature(D) and ABA(E) treatments in soybean seedlings

基因表达量的不同是由其转录水平不同所造成的，逆境诱导下基因表达量的检测结果对于功能基因的筛选与鉴定具有重要的参考价值[24]。本实验对非生物胁迫下GmDof1.5的表达量进行了检测。尽管在响应时间和响应强度上存在差异，但干旱、高盐、高温和低温4种非生物胁迫均可明显诱导GmDof1.5的表达，说明GmDof1.5在大豆非生物胁迫中具有调控作用。且高温胁迫对GmDof1.5表达的影响最为显著，据报道马铃薯和茶树中的Dof转录因子也被高温胁迫诱导上调表达[20，25]。ABA是非生物胁迫响应途径中的重要信号物质之一，且GmDof1.5对ABA处理存在应答，说明GmDof1.5对非生物胁迫的响应可能依赖于ABA信号转导途径。由此推测，GmDof1.5参与大豆对非生物胁迫的响应，但其调控机制等问题仍有待进一步研究。