粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白全长和N端的原核表达与多克隆抗体制备

刘金玉，黄 鹰

(1.长江大学 生命科学学院，湖北 荆州434025； 2.南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京210023)

tRNA在蛋白质合成过程中起着极其重要的作用。生物体内的tRNA首先以前体形式转录而成，经过一系列加工后才能成为有生物学功能的成熟tRNA分子；这些加工包括除去5′前导序列、3′末端序列，切除内含子，修饰碱基和添加3′末端CCA[1]。tRNA前体加工的主要核酸内切酶是RNase P、tRNase Z和tRNA内切酶，其分别参与tRNA前体5′前导序列、tRNA前体3′末端序列和内含子剪接的加工[2-4]。tRNase Z是一种参与tRNA前体3′末端加工的核酸内切酶，属于金属内酰胺酶超家族中的ElaC亚家族成员[5]。许多细菌、大多数真核生物，以及所有古生菌的tRNA前体3′末端加工过程都是由核酸内切酶tRNase Z催化的[6-8]。根据氨基酸序列数目的不同，tRNase Z可分为短型tRNase ZS和长型tRNase ZL。短型tRNase ZS有280～360个氨基酸残基，长型tRNase ZL有750～930个氨基酸残基[9]。短型tRNase ZS存在于细菌、真核生物和古生菌，而长型tRNase ZL仅发现存在于真核生物。不同生物体中存在不同种类和不同数目的tRNase Z。如芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)和果蝇(Drosophilamelanogaster)都只有1个长型tRNase ZL[10-11]；而人有2个tRNase Z，其中1个是短型tRNase ZS，也叫ELAC1，另1个是长型tRNase ZL，也叫ELAC2。人ELAC2基因最初是作为家族性前列腺癌易感基因被发现的，但其突变增加家族性前列腺癌的机制并不清楚[8-9]。粟酒裂殖酵母存在2个tRNase ZL基因，分别为sptrz1和sptrz2，它们是必需基因；sptrz1和sptrz2编码的蛋白(SpTrz1和SpTrz2)与人ELAC2高度同源，分别参与核和线粒体tRNA前体3′末端加工[12]。

目前认为，长型tRNase ZL是在进化中通过短型tRNase ZS的基因复制(duplication)形成的[13-14]。长型tRNase ZL可分为C-末端一半和N-末端一半。tRNase ZL序列的C-末端一半很少分化，而N-末端一半分化程度很高。长型tRNase ZL的C-末端一半主要保留了酶的催化功能，它含有5个高度保守的模体(模体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)，其中模体Ⅱ也称组氨酸模体，序列为HxHxDH(x代表任意疏水性氨基酸残基)，是tRNase Z最具标识的模体。tRNase ZL序列的C-末端一半和短型tRNase ZS的蛋白质一级结构有较高的相似性。而长型tRNase ZL的N-末端一半主要保留了ZiPD(zinc-dependent phosphodiesterase)类型的底物结合功能，它含有1个假模体Ⅱ和一个可变臂，其中假模体Ⅱ也称假组氨酸模体，且与短型tRNase ZS在蛋白一级结构上有较低的相似性。

本实验克隆表达了粟酒裂殖酵母线粒体tRNA 3′末端加工酶SpTrz2的全长和N-末端一半，并制备SpTrz2和SpTrz2 N-末端一半(SpTrz2N)的多克隆抗体，为检测粟酒裂殖酵母SpTrz2的蛋白水平和进一步明确SpTrz2的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

粟酒裂殖酵母单倍体野生型菌株yAS56[(h+，尿嘧啶生物合成缺陷型(ura4-D18)，亮氨酸生物合成缺陷型(leu1-32)]、大肠埃希菌Top10、BL21(DE3)和表达载体pET28a(+)均为本实验室保存。PrimeSTAR高保真聚合酶、rTaqDNA聚合酶、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ，以及连接酶试剂盒和蛋白质分子质量标准购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA分子质量标准购自北京全式金生物技术有限公司；DNA纯化试剂盒、DNA割胶回收试剂盒和PCR过柱纯化试剂盒购自博巧生物科技公司；酵母提取物和蛋白胨购自OXIOD公司；尿嘧啶、亮氨酸、卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)购自西格玛奥德里奇贸易有限公司；其他常用试剂均购自南京丁贝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

芽殖酵母ScTrz1、粟酒裂殖酵母SpTrz2、果蝇DmTrz1和人ELAC2的蛋白质序列来源于NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)，使用Clustal W软件比对分析芽殖酵母ScTrz1、裂殖酵母SpTrz2、果蝇DmTrz1和人ELAC2的N-末端一半序列[15]。采用TMpred软件分析裂殖酵母SpTrz2的跨膜结构域；采用在线工具iedb预测SpTrz2的B细胞表位(http://www.iedb.org/)。

1.2.2 PCR片段扩增

利用Primer 6.0软件分别设计扩增全长sptrz2和N-末端一半sptrz2N基因的特异性引物，如表1所示。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以粟酒裂殖酵母野生型yAS56基因组为模板扩增目的片段[16]。扩增条件为98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用PCR过柱纯化试剂盒进行纯化。

1.2.3 重组载体的构建和鉴定

采用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切PCR产物与pET-28a(+)载体，把酶切产物按连接酶试剂盒说明的配比加入到酶连反应体系，16 ℃连接6 h，将酶连产物转入大肠埃希菌Top10感受态细胞，涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基，37 ℃培养12～15 h。挑取单菌落接种于5 mL含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃振荡培养12 h。通过碱裂解法提取质粒，对重组质粒分别进行PCR鉴定，并送南京思普金生物技术有限公司测序。

1.2.4 重组蛋白的诱导表达与纯化

将测序正确的重组质粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N分别转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞，分别涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基，37 ℃培养12～15 h，得到重组原核表达菌株。分别挑单菌落接种于20 mL的LB液体培养基(含50 μg·mL-1卡那霉素)，37 ℃振荡培养12 h；将重组原核表达菌株分别转接到200 mL LB液体培养基(含50 μg·mL-1卡那霉素)，使其D600为0.2，37 ℃继续振荡培养；当D600达到0.6～0.7时，加入终浓度为1 mmol·L-1的IPTG，37 ℃诱导培养4 h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。4 ℃，8 000 ×g离心，PBS缓冲液(pH为7.4)悬浮洗涤，加入终浓度为0.1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)；4 ℃ 400 W超声破碎，每次工作10 s，间隔10 s，直至破碎完全。4 ℃，12 000 ×g离心，收集上清和沉淀。裂解后的菌液、上清和沉淀分别与10×蛋白上样缓冲液混匀，煮沸10 min，通过12% SDS-PAGE电泳分析融合蛋白SpTrz2和SpTrz2N的表达与可溶性。

1.2.5 粟酒裂殖酵母线粒体的提取

将野生型yAS56菌株接种于20 mL YES液体培养基，30 ℃振荡培养。10 h后转接至500 mL YES液体培养基，使其D600为0.2，30 ℃振荡培养7 h，离心收菌，ddH2O悬浮洗涤，5 000 ×g离心3 min，收集沉淀。50 mL S缓冲液(1.4 mol·L-1山梨醇，1.5 mmol·L-1氯化镁，40 mmol·L-1HEPES)悬浮洗涤，5 000 ×g离心4 min，收集沉淀。50 mL S缓冲液重悬沉淀，30 ℃，10 min轻摇温育，然后5 000 ×g离心5 min，收集沉淀，称量，添加适量的S缓冲液，加裂解酶，振荡孵育3 h，镜检破壁情况，5 000 ×g离心5 min，收集圆球形的原生质体。后续步骤均在4 ℃条件下进行，加入预冷的匀浆缓冲液[600 mmol·L-1山梨醇，10 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.4)，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1PMSF]，用杜恩斯匀浆器匀浆10次，获得的样品即为全细胞蛋白(T)，4 000 ×g离心5 min，收集上清。12 000 ×g离心10 min收集上清(PMS，去除线粒体的上清)和沉淀。适量SEM缓冲液[250 mmol·L-1蔗糖，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1MOPS (pH 7.2)]重悬沉淀，12 000 ×g离心10 min收集沉淀。适量SEM缓冲液重悬沉淀，得到线粒体悬浮液(Mt，线粒体)。

1.2.6 多克隆抗体的制备与检测

目的蛋白SpTrz2和SpTrz2N在大肠埃希菌原核表达系统中主要以包涵体的形式存在。将包涵体蛋白SpTrz2和SpTrz2N分别进行12% SDS-PAGE电泳，电泳结束后分别切胶回收目的条带，蛋白抗原(大于3 mg目的蛋白量，纯度大于90%)适合多克隆抗体的制备。将纯化得到的包涵体蛋白SpTrz2和SpTrz2N样品作为抗原送至南京金斯瑞生物科技有限公司制备相应的多克隆抗体。用酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测多克隆抗体的效价。提取yAS56裂殖酵母的全细胞蛋白(T)，去掉线粒体的上清蛋白(PMS)和线粒体蛋白(Mt)进行12% SDS-PAGE，电泳结束后将其转印至硝酸纤维素膜(NC膜)；用封闭液(0.137 mol·L-1NaCl，0.02 mol·L-1Tris，50g·L-1脱脂奶粉)室温封闭NC膜2 h；再用TBST缓冲液(0.137 mol·L-1NaCl，0.02 mol·L-1Tris，0.1% Tween 20)洗膜3次；按1∶3 000的比例加入一抗，室温孵育4 h，用TBST缓冲液洗膜3次；再按1∶3 000的比例加入二抗(羊抗兔IgG荧光抗体)，室温孵育1 h，用Odyssey双色红外荧光扫描成像系统检测结果。

2 结果与分析

2.1 粟酒裂殖酵母SpTrz2的N端同源性分析

在NCBI数据库下载芽殖酵母ScTrz1(登录号：AHY76312.1)、粟酒裂殖酵母SpTrz2(登录号：NP_595514.1)、果蝇DmTrz1(登录号：NP_724916.1)和人ELAC2(登录号：AAH01939.1)的氨基酸序列。粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的全长由678个氨基酸残基组成，N-末端一半位于该蛋白的1～407位氨基酸处。借助Clustal W软件对芽殖酵母ScTrz1蛋白、粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白、果蝇DmTrz1蛋白和人ELAC2蛋白的N-末端一半序列同源性进行比对分析，结果见图1。

2.2 SpTrz2蛋白的跨膜结构域预测

借助TMpred软件对粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的跨膜情况进行分析，SpTrz2蛋白拥有3个跨膜结构域，其中，2个位于SpTrz2蛋白的N-末端一半序列(47～69位氨基酸和106～129位氨基酸)，第3个位于SpTrz2蛋白的C-末端一半序列(425～451位氨基酸)，结果见图2。

2.3 SpTrz2的免疫原性预测

借助在线工具iedb预测SpTrz2蛋白N-末端一半和C-末端一半的B细胞抗原表位，结果见图3。SpTrz2的N-末端一半和C-末端一半分别有14个和9个预测的B细胞抗原表位，它的氨基酸组成和分布见表2和表3。

2.4 重组质粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N的构建与鉴定

用PCR方法，以粟酒裂殖酵母野生型yAS56的基因组作为模板扩增，获得了全长sptrz2和N-末端一半sptrz2N基因的PCR扩增产物，其大小分别为2 037 bp和1 221 bp，与预期结果相符(图4-A和4-B)。将获得的sptrz2和sptrz2N基因分别克隆到pET28a(+)上。挑选重组质粒进行PCR鉴定，凝胶电泳结果分别与目的基因sptrz2和sptrz2N大小相符，测序结果表明获得的sptrz2和sptrz2N基因序列正确(图4-C和4-D)。表明重组质粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N构建成功，可用于诱导表达蛋白。

2.5 重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N的表达与可溶性分析

将测序正确的重组质粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞，37 ℃经IPTG诱导表达4 h，进行SDS-PAGE电泳分析。重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N主要以包涵体的形式高效表达，上清中也有少量表达，其相对分子质量分别为75.99 ku和44.77 ku，与预期结果一致(图5-A和5-B)。用SDS-PAGE电泳切胶的方法处理包涵体SpTrz2和SpTrz2N，得到纯化的重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N。

2.6 多克隆抗体的制备与特异性分析

将纯化后的重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N送至南京金斯瑞生物科技有限公司制备多克隆抗体。分别提取粟酒裂殖酵母野生型yAS56的全细胞蛋白，去除线粒体的上清和线粒体后进行Western blotting鉴定。以2次免疫后获得的抗SpTrz2和SpTrz2N的兔源血清抗体作为一抗，以抗Sla1抗体作为上样控制一抗，羊抗兔IgG荧光抗体作为二抗进行Western blotting。实验以已知定位于细胞核的Sla1作为对照。结果显示，兔抗SpTrz2和SpTrz2N的多克隆抗体可以检测到线粒体中的天然SpTrz2蛋白，说明制备的多克隆抗体具有SpTrz2蛋白特异性(图6-A和6-B)。但全细胞蛋白和去除线粒体的上清蛋白样品中几乎检测不到SpTrz2蛋白，这是由于SpTrz2蛋白在体内表达量很低(图6-A和6-B)。

图2 SpTrz2蛋白的跨膜结构域Fig.2 Transmembrane domain of SpTrz2 protein

A，SpTrz2蛋白的N-末端一半的B细胞表位；B，SpTrz2蛋白C-末端一半的B细胞表位。A，The B cell epitopes in the N-terminal halve of SpTrz2 protein; B， The B cell epitopes in the C-terminal halve of SpTrz2 protein.图3 SpTrz2蛋白的B细胞表位Fig.3 B cell epitopes in SpTrz2 protein

表2 SpTrz2 蛋白N端B细胞表位的氨基酸序列

表3 SpTrz2蛋白 C端B细胞表位的氨基酸序列

M，DNA分子质量标准；1，sptrz2基因PCR扩增产物；2，sptrz2N基因PCR扩增产物；3～4，重组质粒pET28a-sptrz2的PCR鉴定；5～6，重组质粒pET28a-sptrz2N的PCR鉴定。M， DNA marker; 1， PCR product of sptrz2; 2， PCR product of sptrz2N; 3 and 4， Identification of recombinant plasmid pET28a-sptrz2 by PCR; 5 and 6， Identification of recombinant plasmid pET28a-spTrz2N by PCR.图4 重组质粒pET28a-sptrz2和pET28a-sptrz2N的构建Fig.4 Construction of recombinant plasmids of pET28a-sptrz2 and pET28a-sptrz2N

3 结论与讨论

线粒体tRNase ZL除了参与线粒体RNA加工外，还与线粒体氧化磷酸化系统的复合体合成有关。线粒体tRNase ZL功能异常使线粒体蛋白表达量降低，从而引起线粒体氧化磷酸化的异常，导致线粒体功能障碍[17-19]。许多人类疾病与线粒体功能障碍相关，例如肥厚性心肌病、聋症、线粒体脑病和癌症等[20]。在粟酒裂殖酵母中，SpTrz2蛋白参与线粒体的tRNA前体3′末端加工，还参与线粒体的mRNAs和rRNAs 5′末端的成熟加工[12，21]。许多研究表明，提高SpTrz2蛋白表达量会引起线粒体损伤，可能导致铁稳态，活性氧积累从而诱发凋亡性细胞死亡，但具体机制还需要深入研究[22]。因此，为了研究SpTrz2蛋白表达与线粒体tRNA 3′末端加工过程缺陷之间的关系，以及SpTrz2蛋白在细胞周期调控与细胞凋亡中的功能作用，需要建立SpTrz2蛋白的检测工具。

M，蛋白质分子质量标准；1，未经诱导的SpTrz2重组菌株；2，IPTG诱导的SpTrz2重组菌株；3，诱导后的上清；4，诱导后的沉淀，箭头标示重组蛋白SpTrz2；5，未经诱导的SpTrz2N重组菌株；6，IPTG诱导的SpTrz2N重组菌株；7，诱导后的上清；8，诱导后的沉淀，箭头标示重组蛋白SpTrz2N。M， Protein molecular weight marker; 1， SpTrz2 recombinant strain non-induced; 2， SpTrz2 recombinant strain induced with IPTG; 3， The supernatant of SpTrz2 recombinant strain induced with IPTG; 4， The pellet of SpTrz2 recombinant strain induced with IPTG， the arrow indicated recombinant protein SpTrz2; 5， SpTrz2N recombinant strain non-induced; 6， SpTrz2N recombinant strain induced with IPTG; 7， The supernatant of SpTrz2N recombinant strain induced with IPTG; 8， The pellet of SpTrz2N recombinant strain induced with IPTG， the arrow indicated recombinant protein SpTrz2N.图5 重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N诱导表达的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of induced expression of recombinant protein SpTrz2 and SpTrz2N

T，全细胞蛋白；PMS，去除线粒体的上清；Mt，线粒体。T， Total cell extracts; PMS， Postmitochondrial supernatants; Mt， Mitochondria.图6 SpTrz2和SpTrz2N多克隆抗体的Western blotting检测Fig.6 Western blotting of polyclonal antibodies of SpTrz2 and SpTrz2N protein

在抗体的制备中，酵母表达系统能够进行蛋白翻译后加工，收获的高表达外源蛋白具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，尤其适合于表达真核生物蛋白，这有利于保持外源蛋白的可溶性和活性[23-24]。然而酵母表达系统不适合用于高表达SpTrz2蛋白，因为课题组前期研究发现，高表达SpTrz2蛋白会导致酵母细胞的死亡[12]。大肠埃希菌原核表达系统是生产重组蛋白的一种高效、廉价的表达体系，且其表达量远大于酵母表达系统，但大肠埃希菌表达的基因工程真核蛋白一般以无生物活性的包涵体形式存在[25]。包涵体不仅容易进行有效的分离和纯化，而且其对寄主细胞无毒性作用，因此本研究以大肠埃希菌作为宿主进行粟酒裂殖酵母重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N的异源表达。

本研究采用生物信息学方法分析SpTrz2蛋白的全长和N-末端一半，成功表达了重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N，并进行了纯化和富集，得到大量高纯度重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N，且成功制备了兔抗SpTrz2和SpTrz2N的多克隆抗体。为了后续进一步研究由tRNase ZL和线粒体tRNA加工过程缺陷引发的疾病奠定了基础。