miR-140-5p靶向转化生长因子 β受体Ⅰ调控乳小鼠心肌成纤维细胞的胶原表达

许丹丹，张 毅，张飞雪，孟祥雯

（湖北科技学院医药研究院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100）

心血管疾病作为当今世界严重威胁人类健康的疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤疾病跃居首位［1］。流行病学研究表明，糖尿病与心衰之间有着紧密的联系，糖尿病患者患心衰的风险较非糖尿病人群高2～5倍，糖尿病心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）作为糖尿病性心肌病发展到晚期的共同病理改变，表现为细胞过度增殖、细胞外基质如Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ，CollⅠ）和 CollⅢ过度沉积，心肌舒张功能障碍并最终导致心衰［2］。转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad蛋白信号通路作为一条经典的纤维化信号通路，TGF-β1先与膜上的TGF-β受体Ⅱ（TGF-β receptorⅡ，TβRⅡ）结合形成二聚体，再与TβRⅠ结合，进一步形成复合物，此复合物作用于Smad蛋白C端丝氨酸残基，使Smad2/3磷酸化激活，激活的Smad2/3和Smad4形成转录复合体进入细胞核，调节后续信号通路的转导，最终导致心肌中的CollⅠ和ColⅢ异常增多和比例失调，Smad7蛋白则可抑制Smad2/3/4复合体形成并转录进细胞核，抑制纤维化进程［3］。

微 RNA（microRNA，miR）是一类长度21～22个核苷酸的小非编码RNA，成熟体miR被组装成核糖核蛋白复合物作用于目标基因3’UTR区域从而介导基因转录后或翻译沉默。大量研究表明，miR参与早期发育、细胞增殖与凋亡、脂肪代谢以及细胞分化等重要生命进程［4］，并与很多疾病的发生密切相关。在糖尿病MF中，miR同样发挥着重要作用。研究表明，高浓度葡萄糖（high glucose，HG）刺激可增加miR-21表达并通过细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路加速胶原合成，促进糖尿病MF进程［5］；在糖尿病患者的肝组织中miR-15b表达下调并激活纤维化信号TβRⅠ和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）加速MF进程［6］；miR-200b能介导糖尿病模型小鼠MF进程中内皮间质转化［7］。miR-140-5p作为在心衰进程中异常表达的miR［8］，同时还与肺和滑液囊的纤维化相关［9-10］，但miR-140-5p靶向TGF-β/Smad信号通路调控糖尿病MF还未见报道。因此，本研究采用HG和外源性TGF-β1诱导乳小鼠心肌成纤维细胞（mouse cardiac fibroblasts，MCF）胶原高表达模型，探究miR-140-5p的表达以及miR-140-5p靶向TGF-β/Smad信号通路相关蛋白调控MCF胶原合成的分子机制，为糖尿病MF治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和主要仪器

苯甲基磺酰氟（phenylmeth anesulfonyl fluoride，PMSF）（上海碧云天生物有限公司），RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂（CST公司，美国），矾化钠粉末（Sigma公司，美国），二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白浓度检测试剂盒（Thermo Fisher公司，美国），3×蛋白上样缓冲液（碧云天生物有限公司，上海），电化学发光（electro-chemiluminescence，ECL）显影液（武汉爱博泰克公司），兔抗人源Smad7（A16396）、CollⅠ（A16891）、CollⅢ（A3795）、磷 酸 化 Smad2-S467（AP0269）和Smad2（A7699）单克隆抗体（均ABclonal公司，武汉），兔抗人源β肌动蛋白（3700s）单克隆抗体（CST公司，英国），兔抗人源TβRⅠ（bs-0638R）多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔 IgG抗体（Bioss公司，北京），TRIzol（Thermo Scientific公司，美国），AceQ®Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript®Q RT Super-Mix for qPCR（诺唯赞生物科技公司，南京），HEK293T细胞（沪震实业有限公司，上海），miR-140-5p 模拟物（mimics）（吉马生物，苏州），双荧光素酶报告基因质粒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒（复能基因，上海），LIPOFECTAMINE 2000（Thermo Fisher，美国）H-DMEM培养基和RPMI-1640培养基（Hyclone公司，美国），胎牛血清和OPTI-MEMⅠ培养基（Gibco公司，美国），CO2细胞培养箱和NanoDrop 2000（Thermo Scientific公司，美国），超净工作台（苏州净化设备有限公司，中国），5424R-低温高速离心机（Eppendorf公司，德国），Synergy2-多功能酶标仪（BioTek公司，美国），荧光定量PCR仪、PowerPac Basic-垂直电泳仪和Chemi-Doc XRS+化学发光成像系统（Bio-Rad公司，美国）。

1.2 MCF制备和纯度鉴定

取新生C57BL/6乳小鼠10～15只（湖北省实验动物中心）〔许可证号SCXK（鄂）2015-0018〕，75%乙醇消毒后取心尖，预冷的PBS冲洗后移入安瓿瓶。将组织块尽量剪碎，预冷的PBS清洗1次，加5 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶，于37℃恒温水浴中消化2 min；稍沉淀后，将浑浊上清液加入RPMI-1640完全培养基终止消化；剩下的组织块继续用Ⅱ型胶原酶消化，重复以上步骤至组织块全部消化。将收集到的细胞溶液过200目筛网，1000×g离心10 min，弃上清；将细胞用RPMI-1640完全培养基重悬后接种至培养皿，差速贴壁1.5 h后弃培养基。用预冷PBS吹洗细胞1～2次，加RPMI-1640完全培养基继续培养，得到MCF。待提取的MCF汇合度＞90%，加含EDTA的胰蛋白酶消化至少量细胞脱落，加RPMI-1640完全培养基终止消化。吹打均匀收集到离心管中，1000×g离心5 min，弃上清。用RPMI-1640完全培养基重悬细胞后接种至培养瓶中培养，采用心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts cell，CF）标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和S100A4免疫荧光鉴定MCF纯度。

1.3 荧光定量PCR法检测MCF中miR-140-5p mRNA表达

MCF细胞分为细胞对照组、HG 30 mmol·L-1组和TGF-β15 μg·L-1组。每孔加1 mL Trizol，将细胞吹打下来收集到1.5 mL EP管，加入200 μL氯仿，剧烈振荡，12 000×g，4℃离心10 min。吸取上层水相至新离心管，加等体积异丙醇，上下颠倒混匀，4℃，12 000×g，离心10 min。弃上清，用75%乙醇清洗沉淀，4℃，7500×g，离心8 min。弃乙醇干燥沉淀，加入适量DEPC水溶解沉淀，用Nano-Drop 2000检测RNA的纯度及浓度，用于下一步逆转录。利用miRBASE数据库提供的miR序列信息设计特异性逆转录引物，引物序列为：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTACCA-3’，按AMV法逆转录合成cDNA，采用SYBRGreenⅠ荧光染料法进行荧光定量PCR，结果采用2-△△CT法计算miR-140-5p mRNA表达水平。

1.4 脂质体法转染HEK293T细胞和MCF

HEK293T和MCF以1×108L-1密度接种于6孔板，待细胞生长至80%融合度时，每孔加0.5 mL含血清不含抗生素的H-DMEM培养基；配置转染复合物：对于每个6孔细胞，取50 μL OPTI-MEMⅠ培养基加1.5 μL Lipofectamine 2000试剂为A液，轻轻混匀；取50 μL OPTI-MEMⅠ培养基加miR-140-5p mimics 30 nmol·L-1或质粒DNA 1 ng·L-1为B液；将A液加到B液中，轻轻混合并室温孵育20 min；将复合物（100 μL）缓慢滴入到每孔中并混匀，37℃，5% CO2继续培养12 h，弃转染所用培养基，加1640完全培养基继续培养至48 h，收集细胞。

HEK293T细胞分为细胞对照组、转染miR-140-5p mimics 30 nmol·L-1组、转染含miR-140-5p结合位点的野生型TβRⅠ3’UTR序列双荧光素酶载体（WT）1 ng·L-1组、突变型双荧光素酶载体（MT）1 ng·L-1组、WT 1 ng·L-1+miR-140-5p mimics 30 nmol·L-1组和 MT 1ng·L-1+miR-140-5p mimics 30 nmol·L-1组。MCF细胞分为细胞对照组、转染miR-140-5p mimics组和miR-140-5p mimics+HG 30 mmol·L-1或 TGF-β15 μg·L-1组，处理24 h进行后续实验。

1.5 化学发光检测法测定转染miR-140-5p mimics或含T βRⅠ3’UTR序列的双荧光素酶载体后HEK293T细胞中双荧光素酶报告基因活性

取1.4分组的HEK293T细胞，用1×PBS洗2次，加250 μL l×PLB，室温下晃动10 min，让细胞充分裂解之后收集细胞裂解液，12 000×g离心10 min；取20 μL细胞裂解液上清加到LARⅡ，先测定荧火虫荧光强度F值，再在同一管内加Stop&Glo，测海肾荧光素酶活性R值，通过计算F/R值比较不同组间启动子活性。

1.6 Western印迹法检测转染miR-140-5p mimics MCF中CollⅠ，CollⅢ，T βRⅠ，Smad7蛋白表达及Smad2磷酸化水平

取1.4中分组的MCF细胞，弃培养基用预冷的PBS洗涤细胞2次，吸干残留液体。每孔加100 μL 1×RIPA裂解液，用细胞刮刀将细胞刮落并收集，冰上继续裂解20 min，12 000×g，4℃离心15 min。将上清液转移至新1.5 mL EP管内，BCA法测蛋白浓度，然后将蛋白样品与3×上样缓冲液混匀后，98℃变性5 min，进行SDS-PAGE蛋白电泳，在冰浴条件下250 mA，3 h转膜。转膜结束后，用TBST洗膜3次，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，用1∶1000比例配制的一抗在4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，用1∶10000比例配制的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光法显影，使用ImageJ软件进行半定量分析，以目标蛋白条带的积分吸光度值与内参蛋白条带积分吸光度值比值表示CollⅠ，CollⅢ，TβRⅠ和Smad7蛋白相对表达水平，p-Smad2与Smad2吸光度比值表示Smad2磷酸化水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 MCF纯度鉴定

图1A和1B显示，α-SMA和S100钙结合蛋白A4（S100 calcium binding protein A4，S100A4）被染为红色，定位在细胞质中，细胞核被染为蓝色，提取的细胞呈典型的三角形或梭形，其细胞纯度较高，符合后续实验需求。

2.2 HG和TGF- β1对MCF中miR-140-5p mRNA表达的影响

采用荧光定量检测，检测结果显示，与细胞对照组相比，HG 30 mmol·L-1和TGF-β15 μg·L-1组miR-140-5p mRNA表达均显著降低，分别降低71%和68%（P＜0.05，表1）。

2.3 miR-140-5p与T βRⅠ的靶向结合关系

表2结果显示，与细胞对照组相比，miR-140-5p mimics组和WT组荧光强度降低，降低约26.6%（P＜0.05）；MT组无显著改变；与WT组相比，miR-140-5p mimics+WT组荧光强度约下降52.7%；与miR-140-5p mimics组相比，miR-140-5p mimics+WT组荧光强度下降52.7%，miR-140-5p mimics+MT组荧光强度显著提高（约37.2%，P＜0.05）。

Fig.1 ldentification of mouse cardiac fibroblasts（MCFs）purity extracted from heart tissue of neonatal mice by immunofluorescence （lF）.A：Expression of S100 calcium binding protein A4（S100A4）in MCFs extracted from heart tissue of a neonatal mouse.B：Expression of α-smooth muscle actin（α-SMA）in MCFs extracted from heart tissue of a neonatal mouse.

Tab.1 Effect of high glucose（HG）and transforming growth factor- β1（TGF- β1）on miR-140-5p mRNA expression of MCFs

Tab.2 Effect of transfected miR-140-5p mimics or dual luciferase reporter gene vectors containing 3’UTR sequence of transforming growth factor- β receptorⅠ（T βR Ⅰ）on the activity of dual luciferase reporter gene in HEK293T cells

2.4 miR-140-5p mimics转染对MCF中CollⅠ，CollⅢ，T βRⅠ，Smad7蛋白表达及Smad2磷酸化水平的影响

Fig.2 Effect of miR-140-5p mimics transfection on protein expressions of collagen typeⅠ（CollⅠ），CollⅢ，T βRⅠ，Smad7 and phosphorylation level of Smad2 in MCFs detected by Western blotting.MCFs were transfected with miR-140-5p mimics for 24 h，then treated with HG 30 mmol·L-1 or exogenous TGF-β15 μg·L-1for another 24 h.B and D：semiquantitative results of A and C.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with miR-140-5p mimics group.

Western印迹结果显示，与细胞对照组相比，miR-140-5p mimics组CollⅠ，CollⅢ和TβRⅠ蛋白表达显著下调（P＜0.05），Smad7蛋白水平显著增加（P＜0.05），Smad2磷酸化水平下降；与miR-140-5p mimics组相比，miR-140-5p mimics+HG组CollⅠ，CollⅢ和TβRⅠ蛋白表达显著上调（P＜0.05），Smad7蛋白表达显著下调（P＜0.05），Smad2磷酸化水平上升（P＜0.05）；与miR-140-5p mimics组相比较，miR-140-5p mimics+TGFβ1组CollⅠ，CollⅢ和TβRⅠ上调表达（P＜0.05），Smad7蛋白表达下降（P＜0.05），Smad2磷酸化水平上升（P＜0.05）。

3 讨论

本研究结果表明，HG 30 mmol·L-1或 TGF-β15 μg·L-1处理后MCF中胶原表达显著增加，miR-140-5p表达显著降低，表明miR-140-5p可能参与糖尿病MF体外模型调控，且参与MF调控的TGF-β/Smad信号通路相关蛋白TβRⅠ显著增加，Smad2的磷酸化水平升高，Smad7的表达显著下调，提示HG和TGF-β1能够激活TGF-β/Smad信号通路的转导并最终推进胶原表达促进糖尿病MF进程。双荧光素酶报告基因实验结果显示，转染miR-140-5p mimics或WT组的双荧光素酶活性均显著降低，其中miR-140-5p mimics+WT组的双荧光素酶活性最低，而MT型质粒与miR-140-5p mimics共转染组的荧光强度则显著升高，说明miR-140-5p与TβRⅠ3’UTR存在靶向结合作用，当把TβRⅠ3’UTR序列突变后miR-140-5p则不能与TβRⅠ3’UTR序列靶向结合。MCF单独转染miR-140-5p mimics或转染miR-140-5p mimics后再给予HG 30 mmol·L-1或TGF-β15 μg·L-1结果显示，miR-140-5p mimics能够显著抑制TβRⅠ，CollⅠ和CollⅢ蛋白表达，抑制Smad2磷酸化，上调Smad7蛋白表达；而HG和TGF-β1则能够显著上调miR-140-5p mimic作用后的TβRⅠ，CollⅠ，CollⅢ蛋白表达和Smad2磷酸化水平，并能够抑制Smad7的蛋白表达，这一结果进一步验证了miR-140-5p对TβRⅠ的靶向结合作用，并表明miR-140-5p可以靶向TβRⅠ经调控TGF-β/Smad信号通路相关蛋白对胶原表达起到抑制作用。

本研究结果显示，在HG诱导的糖尿病MF体外模型中，miR-140-5p表达异常降低，同时miR-140-5p可靶向TβRⅠ对疾病模型起到调控作用，这一结果与文献报道的miR-140-5p在心衰模型中表达显著下调且miR-140-5p可靶向TβRⅠ在肿瘤疾病等模型中发挥调控作用相一致［11-13］。

因本研究仅限于体外MCF中进行，缺少小鼠体内实验进一步验证miR-140-5p对TGF-β/Smad信号通路调控作用的作用研究，今后将会在糖尿病小鼠体内MF模型中进一步深入研究miR-140-5p对TGF-β/Smad信号通路的调控作用。