氧化苦参碱通过下调程序性细胞死亡1蛋白表达逆转顺铂耐药非小细胞肺癌细胞A549/Cis的顺铂耐药性

姬颖华，杨晓煜，孟祥丽，王 瑾，路 平

（1.新乡医学院第一附属医院肿瘤科，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院基础医学院病理学系，河南 新乡 453003）

肺癌是全球癌症死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率在我国位于恶性肿瘤第一。肺癌的2种主要类型是小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌病例的85%。由于非小细胞肺癌缺少早期明显症状和检测方法，一般确诊时已经进入癌症中晚期［1］。中晚期非小细胞肺癌的标准疗法是基于顺铂（cisplatin，Cis）和其他化疗药物的联合治疗。近年来，非小细胞肺癌治疗取得了非常大的进步，但总体5年生存率仍很低，而非小细胞肺癌化疗的耐药性是治疗的主要障碍之一［2］。Cis是一种DNA交联剂，是最有效的抗肿瘤药物之一，这类铂络合物在体内发生反应并引起DNA交联，最终触发细胞凋亡［3］，可用于治疗肺癌、卵巢癌和宫颈癌等癌症［4］。但是由于耐药性的发生，使Cis在非小细胞肺癌的治疗疗效减弱，从而导致化疗失败［5］。因此，急需开发新的逆转非小细胞肺癌细胞的Cis耐药性的药物。氧化苦参碱（oxymatrine，Oxy）是从豆科属植物苦参或平科植物广豆根中分离出来的生物碱，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抑制肿瘤细胞生长等作用［6］。已有研究表明，Oxy协同增强Cis在人胃癌细胞中的抗肿瘤作用［7］。本研究探讨Oxy对非小细胞肺癌细胞的Cis耐药性影响及机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

Cis（HPLC≥98%，货号：B24462，上海源叶生物科技有限公司），Oxy（HPLC≥96%，货号：A111286，上海蔚霆生物科技有限公司），RPMI-1640培养基（货号：C21700500BT，上海慧颖生物科技有限公司），胎牛血清、青霉素和链霉素双抗溶液（货号：16000-044、15140122，上海素尔生物科技有限公司），四甲偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒（货号：ab228554，上海艾博抗生物科技有限公司），cDNA逆转录试剂盒（货号：GK8030-20，上海捷瑞生物工程有限公司），SYBR-Green PCR试剂盒（货号：4309155，赛默飞世尔科技公司），BCA试剂盒（货号：BC201，上海易色医疗科技有限公司），兔抗人程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death 1 protein，PD1）单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔单克隆IgG抗体（货号：ab6728，ab36151，上海艾博抗生物科技有限公司），空载对照质粒（no-load control plasmid，pc-NC）、PD1过表达质粒（PD1 overexpressed plasmid，pc-PD1）和各种引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成，Lipofectamine 2000转染试剂（货号：11668-027，上海恪敏生物科技有限公司），FluorChem HD2凝胶成像系统（美国Proteinsimple公司），流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 细胞和培养

非小细胞肺癌细胞A549和对Cis耐药的非小细胞肺癌细胞A549（A549/Cis细胞）（上海素冉生物科技有限公司）。所有细胞在含体积分数为10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1和链霉素100 mg·L-1的RPMI-1640培养基中，于温度为37℃、体积分数为5% CO2条件下培养。

1.3 MTT法检测A549和A549/Cis细胞存活抑制率和耐药指数

将A549或A549/Cis细胞以每孔2×103密度接种96孔板，在RPMI-1640培养基中分别加入Cis 2，4，8，16，32和 64 mg·L-1单独培养24 h或与Oxy 20 mg·L-1（预实验筛选出非毒性浓度）联合培养24 h。每孔加入MTT 20 mL溶液，孵育4 h，终止培养，每孔加入150 mL二甲亚矾，振荡10 min。使用酶标仪在490 nm处检测每个样品的吸光度值（A490nm），计算细胞存活抑制率。细胞存活抑制率（%）=（1-药物处理组A490nm/细胞对照组A490nm）×100%，据此量效曲线计算细胞半数抑制浓度（inhibitory concentration 50，IC50）。耐药指数（resistance index，RI）=A549/Cis细胞IC50/A549细胞IC50。

1.4 A549/Cis细胞转染

使用Lipofectamine 2000试剂进行转染。转染前1 d，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5 mL含血清、不含抗生素的正常生长的培养液中。重组载体pc-PD1和空载体pc-NC分别与转染试剂充分混合，保温25 min，然后加入上述培养细胞中孵育。

1.5 A549/Cis细胞分组和处理

A549/Cis细胞分为细胞对照（未做处理）、Cis 5 mg·L-1、Oxy 20 mg·L-1、Cis 5 mg·L-1+Oxy 20mg·L-1、Cis5mg·L-1+pc-NC、Cis5mg·L-1+pc-PD1和Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1+pc-PD1组。按照分组将转染或未转染质粒的A549/Cis细胞用Cis 5 mg·L-1和（或）Oxy 20 mg·L-1处理24 h。

1.6 流式细胞法检测A549/Cis细胞凋亡

将1.5处理细胞，用胰酶消化，3500×g离心5 min，再按1×109L-1密度重悬。细胞悬液中加入5 mL Annexin-V-FITC和5 mL PI，在黑暗的房间里孵化15 min，然后用流式细胞仪分析细胞凋亡。细胞凋亡率（%）=早期细胞凋亡率（%）+晚期细胞凋亡率（%）。

1.7 RT-qPCR检测A549/Cis细胞PD1 mRNA表达

将1.5各处理细胞，用TRIzol裂解试剂提取总RNA，并用cDNA逆转录试剂盒合成cDNA。RT-qPCR按照SYBR-Green PCR试剂盒说明书操作进行。反应条件为：95℃ 2 min，96℃ 15 s，60℃15 s和72℃1 min的40个循环，PD1的上游引物序 列 ：5′-GCGAATTCATGCAGATCCCACAGGCG-3′；PD1 的下游引物序列：5′-ATCCGCGGCAGGGGCCAAGAGCAGT-3′；GAPDH 的上游引物 序列 ：5′-CCACCCATGGCAAATTCCATG-GCA-3′，GAPDH的下游引物序列：5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC-3′。用 GAPDH 标准化，2-ΔΔCt计算PD1 mRNA表达。

1.8 Western印迹法检测A549/Cis细胞中PD1蛋白表达水平

将1.5处理细胞，加含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，冰上裂解。离心力为15 000×g离心10 min，收集上清。BCA试剂盒检测上清中蛋白浓度，加蛋白上样缓冲液制作蛋白样品。每孔上样30 μg蛋白，使用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜后使用5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，转移至兔来源的单克隆一抗（PD1 1∶1000，GAPDH 1∶1000）中，4℃孵育12 h，洗膜缓冲液洗3次；转移至山羊抗兔单克隆二抗（1∶2000）中，室温下孵育1 h后，洗膜缓冲液洗3次，加显影液，于成像系统中曝光，使用软件ImagePro plus6.0分析蛋白条带积分吸光度，以目标蛋白与内参蛋白GAPDH积分吸光度值的比值表示蛋白表达水平。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 Oxy和Cis对A549/Cis和A549细胞存活抑制率和耐药指数的影响

MTT检测结果显示，如图1A所示，Cis 2，4，8，16，32和64 mg·L-1处理A549和A549/Cis细胞，同一时间点、同一浓度的Cis对A549细胞存活抑制率明显高于A549/Cis细胞（P＜0.05，P＜0.01）。Cis对A549细胞的IC50为10.25 mg·L-1，对 A549/Cis细胞的IC50为36.33 mg·L-1，RI=3.54。如图1B所示，Cis和Oxy 20 mg·L-1均加入A549/Cis细胞后，Cis对 A549/Cis 细胞的 IC50为 10.67 mg·L-1，RI为1.04。且在同一时间点、同一浓度下，与细胞对照组相比，Oxy 20 mg·L-1组A549/Cis细胞存活抑制率显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Effect of oxymatrine（Oxy）and cisplatin（Cis）on the inhibitory rate of non-small lung cancer A549 and Cis resistant A549（A549/Cis）cells examined by MTT assay.A：A549 and A549/Cis cells were treated with Cis 2，4，8，16，32 and 64 mg·L-1for 24 h；B：A549/Cis cells were treated with Oxy 20 mg·L-1+Cis 2，4，8，16，32 and 64 mg·L-1for 24 h.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with A549 cells；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with A549/Cis cell control group.

Fig.2 Effect of Oxy on apoptosis of A549/Cis cells by flow cytometry.A549/Cis cells transfected with or without pc-NC or pc-programmed cell death 1 protein（pc-PD1）plasmids were treated with Cis 5 mg·L-1or/and Oxy 20 mg·L-1for 24 h.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with Cis 5 mg·L-1group；ΔΔP＜0.01，compared with Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1group.

2.2 Oxy对A549/Cis细胞凋亡的影响

流式结果显示（图2），与细胞对照组相比，Cis5mg·L-1组细胞凋亡率无明显变化，Oxy20mg·L-1组细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）；与Cis 5 mg·L-1组相比，Cis 5 mg·L-1+pc-NC组细胞凋亡率无明显变化，Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1组细胞凋亡率显著增加（P＜0.01），Cis 5 mg·L-1+pc-PD1组细胞凋亡率显著减少（P＜0.01）；与Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1组相比较，Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1+pc-PD1组细胞凋亡率显著减少（P＜0.01）。

2.3 Oxy对A549/Cis细胞PD1 mRNA表达的影响

RT-qPCR结果显示（表1），与细胞对照组相比，Cis 5 mg·L-1组PD1 mRNA表达无明显变化，Oxy 20 mg·L-1组PD1 mRNA表达显著下调（P＜0.05）；与Cis 5 mg·L-1组相比，Cis 5 mg·L-1+pc-NC组PD1 mRNA表达无明显变化，Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1组PD1 mRNA表达显著下调（P＜ 0.01），Cis 5 mg·L-1+pc-PD1组PD1 mRNA表达显著上调（P＜0.01）；与Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1组相比较，Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1+pc-PD1组PD1 mRNA表达显著上调（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of Oxy on PD1 mRNA expression in A549/Cis cells

2.4 Oxy对A549/Cis细胞PD1蛋白表达的影响

如图3所示，与细胞对照组相比，Cis 5 mg·L-1组A549/Cis细胞中PD1蛋白表达无明显变化，Oxy 20 mg·L-1组A549/Cis细胞中PD1蛋白表达显著下调（P＜0.05）；与Cis 5 mg·L-1组相比，Cis 5 mg·L-1+pc-NC组A549/Cis细胞中PD1蛋白表达无明显变化，Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1组A549/Cis细胞中PD1 蛋白表达显著下调（P＜0.01），Cis 5 mg·L-1+pc-PD1组A549/Cis细胞中PD1蛋白表达显著上调（P＜0.01）；与Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1组相比较，Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1+pc-PD1组A549/Cis细胞中PD1蛋白表达显著上调（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of Oxy on PD1 protein expression in A549/Cis cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with Cis 5 mg·L-1group；ΔΔP＜0.01，compared with Cis 5 mg·L-1+Oxy 20 mg·L-1group.

3 讨论

本研究结果表明，Cis对A549细胞的IC50为10.25mg·L-1，对 A549/Cis细胞的IC50为36.33mg·L-1，RI=3.54；而Oxy 20 mg·L-1与Cis共处理A549/Cis细胞后，使Cis对A549/Cis细胞IC50为10.67 mg·L-1，RI为1.04。同时还表明，Oxy可显著增加A549/Cis细胞凋亡率，Oxy显著下调A549/Cis细胞中PD1 mRNA和蛋白的表达；而过表达PD1可逆转Oxy对A549/Cis细胞促进凋亡的作用。

Oxy是从豆科属植物苦参或平科植物广豆根中分离出来的生物碱，用于慢性乙肝治疗、肿瘤放疗化疗等［8-9］。天然植物活性成分具有多靶向特点，同时具有安全性高、毒性小等优点，有望成为逆转非小细胞Cis耐药性的候选药物。已有研究表明，Oxy抑制非小细胞肺癌细胞的锚定依赖和独立生长，但对正常肺细胞无细胞毒性［10］，说明Oxy可用于非小细胞肺癌的治疗，且无毒副作用。已有报道，Oxy可逆转鼻咽癌、乳腺癌等癌症耐药细胞的耐药性［11］。Oxy可通过内质网应激诱导的细胞凋亡途径来诱导非小细胞肺癌细胞死亡，并通过抑制上皮间质转化过程来降低非小细胞肺癌细胞转移潜能［12］。然而，Oxy对A549/Cis细胞具体作用和机制尚不明确。本研究结果表明，非细胞毒性浓度的Oxy可逆转A549/Cis细胞的Cis耐药性。Cis耐药与以下机制有关：DNA损伤/修复蛋白、药物滞留（例如流入量增加或摄取减少）、药物失活增加、阻止药物到达DNA靶点、抑制凋亡和缺氧诱导的自噬［13］。肿瘤细胞对化疗耐药的实质是药物不能活化其凋亡途径［14］。本研究发现，Oxy可显著增加A549/Cis细胞对Cis的敏感性。

已往研究表明，Oxy和Cis协同增强非小细胞肺癌CD8+T细胞的抗肿瘤免疫，提示Oxy联合Cis可能为非小细胞肺癌患者提供潜在的免疫治疗［15］。与已有报道，PD1/PD-L1免疫检查点抑制剂作为非小细胞肺癌新的治疗手段相对应［16］。本研究表明，Oxy下调A549/Cis细胞中PD1 mRNA和蛋白的表达，而过表达PD1逆转Oxy对A549/Cis细胞的促凋亡作用，说明Oxy通过下调PD1逆转A549/Cis细胞对Cis的耐药性。PD1是一种人PD1基因编码的Ⅰ型跨膜蛋白，是一种抑制性免疫检查点抑制剂，在维持外周T淋巴细胞的耐受性和调节炎症中起着重要的作用［17］。在其配体PD-L1/PD-L2参与肿瘤微环境后，PD1抑制效应T细胞活化，从而保护癌细胞免受免疫介导的排斥［18］。已有众多研究表明，在肿瘤组织中PD1的转录表达水平明显升高，并影响疾病的预后，如，在胃癌中PD1表达水平上调，且PD1的表达水平可为胃癌的临床诊断、预后评估等提供可靠参考依据［19］。有研究结果显示，细胞固有表达的PD1和PD-L1是小细胞肺癌细胞在Cis选择下持续扩增所必需的，升高的细胞PD1/PD-L1表达赋予小细胞肺癌细胞对Cis耐药性相一致［20］。本研究结果与上述研究一致。

综上，Oxy通过下调PD1促进A549/Cis细胞凋亡，并逆转其对Cis的耐药性。本研究仅为其体外作用和机制的初步探讨，体内作用和更加详细的信号通路机制还有待进一步研究。