以NAD+为靶点治疗衰老及其相关疾病研究进展

戴佳晟，王彦泽，刘 鑫

（哈尔滨医科大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150081）

近年来，衰老相关疾病的发病率不断增加，如何抗衰老已成为目前研究的热点［1］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）是细胞生命活动中的重要辅酶，催化多种代谢及氧化还原反应。多项研究表明，在衰老过程中体内NAD+含量逐渐降低，并且NAD+代谢异常会诱发多种衰老相关疾病的产生，如中枢神经系统退行性疾病、心血管疾病和肿瘤等，而恢复体内的NAD+水平则可以改善疾病状况，甚至延长寿命。因此，NAD+目前已经成为抗衰老及相关疾病的“明星靶点”［2］。本文对近年来有关NAD+在衰老及相关疾病中的研究进行综述，以期为相关疾病的治疗提供理论依据与参考。

1 衰老概述及生物标志物

衰老是机体生长发育达到成熟期以后，各组织、器官随着年龄增长而发生退行性变化的过程［3］。随着生命科学研究的发展，人们对衰老发生机制的认知逐渐清晰，端粒酶学说、氧化应激学说、体细胞突变学说、脂褐素学说和内分泌功能减退学说等被人们广泛接受。然而对于衰老的预防和相关治疗药物的研发并未取得显著成效，衰老相关疾病仍是导致死亡的主要原因。这其中包括神经退行性疾病〔帕金森病和阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）等〕、代谢综合征（冠心病和糖尿病等）、肿瘤（乳腺癌和肾细胞癌等）、年龄相关性疾病（白内障和黄斑病变等）和免疫系统疾病（系统性红斑狼疮等）等［4］。

衰老是不可避免、不可逆转的过程，目前研究已确定了多种与哺乳动物衰老相关的生物标志物，这些标志物伴随着衰老的发生而产生，可能参与调节衰老的病理变化，也可由衰老诱发。

早期衰老生物标志物是以时间年龄而非生物学年龄作为评判指标和独立因素来确定。BAI等［5］的最新研究证实，单个生物标志物不可能准确反映机体的衰老状态，并从衰老变化的108个指标中选择了7种与衰老最为相关的生物标志物，并确定生物学年龄得分=0.248×实际年龄+0.195×颈动脉内膜中层厚度-0.196×颈动脉舒张末期血流速率-0.167×左心室舒张早期充盈峰与二尖瓣心房收缩期充盈峰之比-0.166×二尖瓣环侧壁充盈早期峰流速度+0.188×动脉脉压+0.182×血浆纤维蛋白原浓度+0.193×血清胱抑素C浓度。

随着生命科学研究的发展，人们逐渐认识到生物标志物的复杂性和功能多样性，现有疾病生物标志物的确定均需综合疾病进展、临床诊断、药物治疗和个体差异等因素。CARDOSO等［6］的研究较为全面地概括了在研衰老标志物，作者在基因表达数据库（GenAge，Longevity Map等）中筛选在寿命和衰老相关疾病中具有异常变化的基因，尤其识别在体液中存在并可被检测到的基因，作为潜在的衰老生物标志物，最终得到19个候选因子，按衰老的主要病理过程分为7类。①炎症：CXC趋化因子配体10、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）和C-X3-C基序趋化因子配体1；②线粒体和细胞凋亡：生长分化因子15、纤连蛋白Ⅲ型结构域和波形蛋白；③钙稳态：钙调素和钙网蛋白；④纤维化：尿激酶和血管紧张素原；⑤神经肌肉接头和神经元：脑源性神经生长因子和颗粒蛋白前体；⑥细胞骨架和激素：α-klotho蛋白、成纤维细胞生长因子23、成纤维细胞生长因子21和瘦素；⑦ 其他：微RNA（micro RNA，miRNA）、腺苷同型半胱氨酸酶和角蛋白18。NAD+及相关代谢因子包括CD38、抗衰老酶（sirtuin，SIRT）和烟酰胺磷酸核糖基转移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT）被认为是衰老的新兴标志物。多项研究证实，NAD+随机体年龄增长表达急速下降，且外源补充NAD+能够延缓衰老，以NAD+为核心的治疗策略已成为对抗衰老及相关疾病的热门方向（表1）。

表1 NCBI基因库中人类衰老标志物的基因ID及其在衰老过程中的表达趋势

2 NAD+概述

人们在20世纪初就发现了NAD+，并开始着手研究其结构和功能。现已明确NAD+的化学结构为磷酸核苷酸糖，其主要功能为细胞氧化还原反应所需的重要辅酶，协助关键代谢途径中的氢转移［40］，包括糖酵解中的3-磷酸甘油醛脱氢反应，三羧酸循环中的部分氧化反应，以及线粒体中的脂肪酸和氨基酸氧化等过程。在线粒体中的脂肪酸和氨基酸氧化过程中，NAD+均转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），而NADH用于氧化磷酸化及作为ATP合成的电子供体［41］。除此之外，NAD+还作为3类酶〔SIRT、ADP核糖基转移酶（adenosine diphosphate ribosyl transferase，ADPRT）或聚核糖基聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）以及环ADP核糖合成酶（CD38和CD157）〕的重要底物，共同参与调控细胞凋亡、肿瘤进展、细胞衰老、DNA修复和线粒体生物合成等过程［42］。

3 NAD+的生物合成

NAD+除了参与线粒体三羧酸循环以及作为酶的底物而被降解，还会在糖酵解等其他的分解代谢途径中被消耗［42］。因此生物体需要依赖几种合成途径来维持细胞内NAD+的水平。NAD+前体有4种：烟酸、烟酰胺、色氨酸和烟酰胺核糖（nicotinamide ribose，NR）。

第一种合成途径是通过Preiss-Handler途径。该途径中的关键酶是烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶（nicotinamide mononucleotide adenyltransferace，NMNAT），其具有3种亚型（NMNAT1～NMNAT3），且以NMNAT1的酶活性最强［43］。NMNAT在ATP存在下将烟酸单核苷酸转化为烟酸腺嘌呤二核苷酸（nicotinic acid adenine dinucleotide，NAAD），NAAD 再被催化成 NAD+［33，44］。

第二种合成途径是通过犬尿氨酸途径，由色氨酸合成NAD+。以吲哚胺2，3-双加氧酶或色氨酸2，3-双加氧酶为关键酶，将色氨酸转化为N-甲酰犬尿氨酸，后者再依次转化为L-犬尿氨酸、5-羟基-2-氨基苯甲酸、2-氨基-3-羧酸黏康酸-6-半醛（2-amino-3-carboxymuconate-6-semialdehyde，ACMS），最后变成喹啉酸。该途径中的另一个关键步骤是ACMS的转化，NAD+合成的前体ACMS自发地缩合并重排为喹啉酸酯。在大多数情况下，ACMS会被ACMS脱羧酶脱羧成2-氨基-3-黏康糖-6-半醛（2-amino-3-muconose-6-semialdehyde，AMS），从而通过柠檬酸循环被氧化成乙酰辅酶A。如过量的色氨酸超出了ACMS脱羧酶的酶促能力，喹啉酸酯将转化为NAMN，从而进入Preiss-Handler合成途径［33，44］。

在哺乳动物中还存在补救途径，也是产生和维持细胞内NAD+水平的重要途径。动物研究表明，NAMPT作为NAD+补救途径中的关键酶，在维持细胞内NAD+水平方面发挥着重要作用［45］。NAD+在消耗酶（SIRT，ADPRT和PARP）的作用下，产生酶活性的副产物——烟酰胺。烟酰胺通过NAMPT先转化为烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN），再在NMNAT催化下合成NAD+。烟酰胺作为抑制因子调节NAD+活性［46］。还有一条补救途径是以NAMPT为关键酶，将ATP的腺苷酸部分缀合至 NMN 来产生 NAD+［33，44］。

4 NAD+在衰老进展过程中的变化及机制

研究已证实，小鼠大脑、肝和胰腺等多个器官中的NAD+含量随其年龄的增长而下降［47-49］。也有研究发现，NAD+水平下调能诱发衰老及相关表型的出现。降低NAD+含量能促进实验动物提前进入衰老［40］。而衰老过程中NAD+含量的下降可导致细胞核中SIRT1的活性降低，从而破坏线粒体功能。提高老年小鼠体内的NAD+水平则以SIRT1依赖的方式恢复线粒体功能［50］。烟酰胺核苷激酶1（nicotinamide riboside kinase 1，NRK1）是肝细胞中NR诱导NAD+合成的限速酶和必要酶。SAMBEAT等［51］发现，NRK1缺失限制PARP活性并加重DNA损伤，导致基因组不稳定，进一步促进细胞衰老和炎症发生，加剧衰老相关的神经变性。目前已发现，昼夜节律、慢性炎症、miRNA、DNA损伤和CD38是影响NAD+水平的5个主要因素［45］。

4.1 昼夜节律

生物钟基因中的Clock基因和Bmal1基因是调节昼夜节律的关键转录因子复合体，该复合体通过与NAMPT的启动子区域结合来调节NAMPT的表达，昼夜节律活动随机体衰老而发生改变，这使得Clock基因表达丰度下降，进一步导致NAMPT和NAD+的缺乏；此外，SIRT1可使BMAL1脱乙酰化，从而调节生物钟基因的表达，并且NAMPT-NAD+-SIRT1调控通路会放大NAD+和NAMPT水平的昼夜节律振荡［52-55］。以上研究表明，在衰老的进展过程中，昼夜节律与NAD+水平相互影响，昼夜节律也是衰老进展过程中的潜在调节因素。

4.2 慢性炎症

炎症细胞因子中的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和氧化应激反应可显著降低NAMPT和NAD+的水平［56］。TNF-α抑制小鼠肝和视交叉上核中Clock/Bmal介导的昼夜节律周期，同时氧化应激反应显著降低原代肝细胞的NAMPT和NAD+水平［57］。TNF-α，IL-1和IL-6以及氧化应激都促进衰老过程中慢性炎症的发展，慢性炎症可能是衰老过程中NAMPT介导的NAD+生物合成和受损的原因。

4.3 miRNA

miRNA通过结合于靶基因的3′端非翻译区抑制基因的表达，已被证明在多种生理和病理状态下发挥重要的转录后调控作用。研究表明，miRNA在衰老及相关疾病进展中发挥重要作用。CHOI等［58］的研究表明，肥胖症患者肝miRNA-34a（miR-34a）的水平显著升高，miR-34a通过靶向作用于SIRT1降低其表达。此外，miR-34a还可通过直接抑制NAMPT表达进而降低NAD+水平和SIRT1活性。在肝中过表达miR-34a则降低NAMPT/NAD+水平，导致肥胖。这说明miR-34a具有潜在调控NAD+及衰老的作用。

4.4 DNA损伤

NAD+减少也可能是由PARP介导的NAD+耗竭导致的，PARP被认为是老化过程中主要消耗NAD+的酶［59］。SCHEIBYE-KNUDSEN 等［60］的研究阐明，科凯恩综合征B（Cockayne syndrome B，CSB）蛋白被PARP产生的聚腺苷二磷酸-核糖基化蛋白募集到DNA损伤的位点并置换PARP，从而使DNA修复得以进行。因此，在缺少CSB的细胞中，活性PARP将持续存在于DNA受损部位，从而加剧NAD+的消耗，并加剧DNA损伤。

4.5 CD38

除上述因素外，SCHULTZ等［61］认为，CD38也是影响NAD+水平的一个重要因素。其研究发现，32月龄的野生型小鼠的NAD+水平大约是幼鼠的一半，但CD38敲除小鼠的NAD+水平下降。过表达CD38的肝细胞线粒体氧消耗明显减少，而线粒体功能障碍是衰老期间代谢水平下降的重要标志，说明CD38可能通过影响线粒体功能进而调控衰老。CAMACHO-PEREIRA等［62］也发现，CD38过表达的细胞表现出较高的NAD+糖水解酶活性，以及较低的NAD+和NADH水平，表明衰老小鼠中CD38至少部分通过调节NAD+表达水平影响线粒体功能。

5 NAD+在衰老及其相关疾病中的作用

上述研究显示，NAD+在衰老进展过程中受各种因素影响而表达下调，并可作为衰老发生的生物标志物，随之又有诸多NAD+对衰老及相关疾病的作用研究，探讨了恢复NAD+水平作为抗衰老策略的可行性［63］。

5.1 NAD+对寿命和心脏衰老的影响

5.1.1 寿命

ZHANG等［64］发现，NAD+可恢复失活干细胞的功能。通过饮食补充老年小鼠NAD+前体NR 6周，能显著延长衰老小鼠寿命〔普通饮食组（829±12）d；NR治疗组（868±12）d〕，这种作用是通过NAD+作用于SIRT1继而激活线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response，UPRmt），最终通过改善线粒体功能而产生的。MOUCHIROUD等［59］建立了秀丽隐杆线虫和小鼠的衰老模型，发现PARP通过调节NAD+水平调控线粒体功能，在维持线粒体和机体功能方面发挥重要的作用。消耗NAD+水平使线虫的寿命显著缩短，而外源性给予NAD+则抑制线虫的衰老过程并延长其寿命。机制研究发现，NAD+通过sir-2.1基因的过度表达诱导有丝分裂蛋白表达失衡，并通过激活UPRmt促进转录因子DAF-16的核转运和激活，共同参与调节线粒体功能，最终影响机体寿命。YOSHIDA等［38］发现，在脂肪组织特异性过表达NAMPT可增加衰老小鼠血循环中细胞外烟酰胺磷酸核糖基转移酶（extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase，eNAMPT）的水平，eNAMPT能够促进多种组织中NAD+的表达，并延长雌性小鼠的健康期。此外，从幼鼠中分离的含eNAMPT的细胞外囊泡可显著延长衰老小鼠的寿命。这些研究表明，提高NAD+水平可延迟实验模型动物的正常衰老。

研究也证实NAD+可作为抗衰老药物靶点。对小鼠过表达SIRT1/SIRT6，或给予小鼠SIRT激活复合物（sirtuin-activating compound，STAC）如白藜芦醇和SRT2104，或以NAD+前体作用于小鼠后，小鼠寿命得以延长，器官功能、身体耐力、抗病性得到明显提高。在非人类灵长类动物和人类中进行的试验也表明，STAC在治疗炎症和代谢性疾病等方面是安全有效的［37］。

5.1.2 心脏衰老

在WANG等［65］的研究中，D-半乳糖胺（D-galactosamine，D-Gal）诱导的衰老H9C2细胞和衰老小鼠心肌组织中发现CD38表达上调，并且NAMPT和SIRT1的表达下调。敲除CD38可显著减少衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量，同时能降低衰老H9C2细胞中P16和P21的表达，减少细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。抑制SIRT1可部分逆转CD38敲除对H9C2细胞衰老和氧化应激反应的影响。此外，补充NAD+可有效抑制D-Gal诱导的细胞衰老，减少ROS产生和降低MDA含量。以上研究说明敲除CD38通过NAD+/SIRT1信号通路延缓心肌细胞衰老，CD38也可作为补充NAD+的有效作用靶点。

5.2 NAD+对衰老相关疾病的影响

5.2.1 神经系统退行性疾病

神经系统退行性疾病主要包括帕金森病和AD，是年龄高度相关的恶性神经系统疾病。FANG［66］对AD发病机制的研究发现，与对照组相比，AD患者死后脑海马组织显示出受损的线粒体积累和线粒体数量减少，表明线粒体损伤可能是AD病理进程的主要驱动力，恢复NAD+水平能通过维持线粒体功能改善AD中的认知丧失，证实NAD+有望成为AD的治疗靶点。FANG等［67］建立了共济失调毛细血管扩张模型。实验数据表明，在共济失调毛细血管扩张综合征（ataxia capillary dilatation syndrome，A-T）中存在线粒体动力学特征紊乱，主要表现为线粒体分裂和融合的不平衡以及线粒体自噬的降低。而外源性补充NAD+前体NR能通过上调SIRT1活性维持线粒体动力平衡，上调线粒体自噬水平，且能促进ATM-KD神经元中DNA的修复，进一步改善A-T的临床症状。

5.2.2 肿瘤

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）细胞和PDAC组织中NAD+补救途径的限速酶NAMPT表达显著增加。下调NAMPT能够在体内外抑制肿瘤的发生和生长，表明是由细胞内NAD+水平和糖酵解活性降低导致［68］。同时，FK866（NAMPT抑制剂）能够增强吉西他滨（嘧啶类抗肿瘤药物）在PDAC细胞和小鼠PDAC模型中的抗肿瘤活性。miR-206的表达下调是NAMPT表达异常的原因，证明miR-206和NAMPT可作为PDAC治疗的有效药物研发靶点。在其他肿瘤中，NAD+也被证明是可靠的药物靶点，抗肿瘤药物丹参酮ⅡA和β-拉帕醌可以通过降低L型氨基酸转运体1的表达来阻断色氨酸的转运，从而抑制细胞内NAD+合成，最终使肿瘤细胞能量代谢受阻［69］。此外，PARP抑制剂奥拉帕尼、尼拉帕尼和卢卡帕尼等能够用于治疗卵巢癌和乳腺癌，目前大部分的PARP抑制剂均以NAD+中的烟酰胺结构为母体，并通过与NAD+竞争结合PARP催化域上的NAD+结合位点来发挥作用，这也进一步说明PARP抑制剂是调控NAD+功能的潜在候选药物［70］。

5.2.3 糖尿病

糖尿病的发生比例与年龄呈显著正相关，衰老是糖尿病的重要危险因素，最新统计数据显示，糖尿病已成为中老年人致死的主要疾病之一［71］。YANG等［72］探究了NAD+对2型糖尿病动物模型OLETF大鼠的影响。连续4周每天给予大鼠烟酰胺100 mg·kg-1能显著降低糖尿病大鼠空腹血糖和胰岛素水平，胰岛素抵抗也得到明显缓解。而给予同样剂量烟酸组的大鼠，降糖效果不如烟酰胺组明显。该研究表明，NAD+调节剂能够改善糖尿病大鼠的糖代谢，为糖尿病的临床治疗提供了参考。

6 结语

目前，NAD+相关药物已成为被大众所期待的新兴抗衰老策略，其前体物质NR和NMN为目前药物开发的热点方向，在过去几年，NMN仅作为科研材料面向研究机构销售且价格昂贵。近几年，通过一定的生物技术，NMN在人体内的吸收及活性得以增强，并且其生产成本也有所降低，目前已有成熟型NAD+前体NMN衰老抑制剂的产品上市。但此产品以营养补充剂形式上市，未经过美国食品药品监督管理局的药物安全性和有效性测试，且人体实验数据匮乏，其长期服用的人体收益与风险未知，因此，更期待以NAD+为靶点开发出更多的抗衰老药物问世，如与NAD+合成或降解相关酶的激活剂或抑制剂、NAD+药代活性产物等均可能是药物研究的潜在方向。NAD+的作用机制与有效药物亟待更多研究来深入阐明与发掘。