榆黄蘑不同生长发育期胞外酶活性变化研究*

雷 萍，吴亚召，张文隽，马婧嘉，贾 静，马 莹

（1.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2.陕西崇德生物技术发展有限公司，陕西 高陵 710200）

榆黄蘑（Pleurotus citrinipileatus Sing.）隶属于担子菌纲 （Basidiomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 侧耳科（Pleurotaceae） 侧耳属（Pleurotus），又名金顶侧耳、金顶蘑等[1]。榆黄蘑味道鲜美、香味浓郁、营养丰富，其干品子实体含粗蛋白41.5%、粗脂肪3.8%、粗纤维 8.4%，总氨基酸 28.65%，人体必需的8种氨基酸含量丰富，也含有Fe、Zn、Se、P、K等微量元素，是高蛋白、低脂肪的绿色保健食品[2]。榆黄蘑药用价值极高，具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、降血脂、保肝护肝等药理功能[3-4]。

20世纪70年代我国开始进行榆黄蘑人工栽培试验，近年来栽培面积不断扩大，在全国范围内已形成一定的规模。榆黄蘑栽培原料主要为阔叶树木屑或农作物秸秆，生长发育过程中需要将培养基中的纤维素、半纤维素、木质素等大分子物质分解成小分子物质，以供菌丝吸收利用[5]。而对这些大分子物质进行降解转化的是菌丝分泌的各种胞外酶，主要包括纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶等。研究不同生长阶段胞外酶的分泌特点、活性大小以及动态变化趋势，可推测出生产发育过程中不同阶段培养基中木质纤维素、淀粉等营养成分的降解动态，从而为选择优良菌株、优化栽培培养基和栽培管理条件提供一定的试验依据[6]。以棉籽壳、木屑为主要栽培培养料，对榆黄蘑栽培过程不同生长期分泌的7种胞外酶活性进行测定，以了解其胞外酶变化规律，推测不同发育阶段的营养生理需求，为榆黄蘑高产菌种选育和人工高产栽培提供科学、系统的理论数据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

榆黄蘑1号、榆黄蘑SW06、榆黄蘑29号，均为陕西省微生物研究所微生物资源中心保藏菌种。

1.2 培养基

1.2.1 母种培养基

马铃薯250 g（去皮、煮汁）、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g，KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g，酵母膏 2.0 g，VB110.0 mg，琼脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

1.2.2 栽培培养基

棉籽壳75%、木屑13%、麸皮10%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%～65%。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种培养及栽培

按上述栽培培养基制备菌袋，选用17 cm×33 cm×0.005 cm聚乙烯塑料袋装料，每袋装干料580 g，高压灭菌后冷却至室温；分别接入榆黄蘑1号、榆黄蘑SW06、榆黄蘑29号菌种，恒温25℃遮光培养；菌丝长满菌袋后进行常规出菇管理，出两潮菇后采收。

1.3.2 粗酶液的制备

在菌丝培养和栽培过程中，分别于菌丝生长至菌袋1/2、菌丝满袋、现蕾、幼菇期、一潮菇子实体成熟、二潮菇现蕾、二潮菇幼菇期、二潮菇子实体成熟和二潮菇采收1周共9个阶段取样。取培养基上、中、下部位的培养料20 g，混匀后加入100 mL蒸馏水，20℃浸提4 h后过滤，4 000 r·min-1离心5 min，取上清液即为粗酶液[7]。

1.3.3 酶活性的测定

分别按参考文献 [8-12]测定7种胞外酶活性，滤纸纤维素酶（FP） 60 min内催化底物生成1 mg葡萄糖所需的酶量为1个活力单位；羧甲基纤维素酶（CMC）、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶30 min内催化底物生成1 mg葡萄糖所需的酶量为1个活力单位；半纤维素酶（HC）30 min内催化底物生成1 mg木糖所需的酶量为1个活力单位；漆酶（LAC）、过氧化物酶1 min使OD值改变0.01所需的酶量为1个活力单位。

2 结果与分析

以编号1～9表示菌丝生长的各个阶段（1为菌丝生长至菌袋1/2；2为菌丝满袋；3为现蕾；4为幼菇期；5为一潮菇子实体成熟；6为二潮菇现蕾；7为二潮菇幼菇期；8为二潮菇子实体成熟；9为二潮菇采收），检测7种胞外酶各阶段活性。

2.1 榆黄蘑不同生长期滤纸纤维素酶活性的变化

3株榆黄蘑不同生长阶段滤纸纤维素酶活性变化情况见图1。

从图1可以看出，3株榆黄蘑菌种栽培过程中培养基中均能测出滤纸纤维素酶活性，酶活性变化趋势基本一致；但不同菌株同一生长阶段的酶活性有一定差异，榆黄29号产生的滤纸纤维素酶活性最大。在菌丝生长初期滤纸纤维素酶活性均较低，随着菌丝生长、原基形成和子实体生长，在幼菇期酶活性达到了最大，分别为15.42 U、16.52 U和17.48 U；幼菇期后滤纸纤维素酶活性逐渐降低，在二潮菇现蕾期活性达到最低，之后酶活性又开始上升，在二潮菇幼菇期达到较大，分别为10.19 U、13.09 U和14.87 U；二潮菇幼菇期后又逐渐下降，至二潮菇采后1周时降至最低，分别为3.94 U、5.13 U和6.01 U。

2.2 榆黄蘑不同生长期羧甲基纤维素酶活性的变化

3株榆黄蘑不同生长阶段羧甲基纤维素酶活性变化情况见图2。

从图2可以看出，3株榆黄蘑菌种在整个生长发育过程中羧甲基纤维素酶活性变化规律基本一致，在菌丝生长和原基形成阶段酶活性均较低，增长缓慢；原基形成后至幼菇期酶活迅速达到最大值，榆黄蘑1号、榆黄蘑SW06、榆黄蘑29号分别达到22.04 U、25.18 U和27.32 U；随着子实体成熟和采收，至二潮菇现蕾期羧甲基纤维素酶活性又迅速降至较低，分别为10.14 U、10.88 U和12.41 U；二潮菇现蕾期后酶活又有逐渐升高，在二潮菇幼菇期达到了1个小高峰，随后酶活性下降，至采收后1周时降至最低，分别为7.99 U、10.16 U和11.45 U。其中以榆黄蘑29号在栽培过程中产生的羧甲基纤维素酶酶活性最大。

2.3 榆黄蘑不同生长期β-葡萄糖苷酶活性的变化

3株榆黄蘑不同生长阶段β-葡萄糖苷酶活性变化情况见图3。

从图3可以看出，3株榆黄蘑菌种在栽培过程中β-葡萄糖苷酶活性变化规律基本一致，但不同菌株同一生长阶段的酶活性存在一定差异，其中榆黄蘑29号产生的β-葡萄糖苷酶活性相对较高。在菌丝生长期间3株菌的酶活性均较低，随着菌丝生长、原基形成和幼菇生长酶活性缓慢上升，幼菇期后酶活性又缓慢降低，一潮菇子实体成熟期达到1个较低值；之后，缓慢上升至二潮菇现蕾时酶活又达到相对较高，分别为7.13 U、10.42 U和11.97 U；随后酶活逐渐下降，直至采收结束酶活性降至最低。β-葡萄糖苷酶在整个栽培过程中没有出现明显的活性高峰和阶段性变化。

2.4 榆黄蘑不同生长期淀粉酶活性的变化

3株榆黄蘑不同生长阶段淀粉酶活性变化情况见图4。

从图4可以看出，3株榆黄蘑菌种在栽培过程中淀粉酶活性变化趋势基本一致，但不同菌株同一生长阶段的酶活性存在一定差异，其中榆黄蘑SW06产生的淀粉酶活性相对较高。在菌丝生长初期3株菌的淀粉酶活性均较低，随着菌丝生长和原基形成对淀粉类物质的分解利用，淀粉酶活性逐渐升高，在幼菇期淀粉类酶活力达到最大，分别为32.26 U、36.91 U和35.12 U；之后，酶活性随着栽培时间的延长逐渐下降，在采收结束1周时测定的酶活性降至最低，分别为1.68 U、2.93 U和2.02 U。

2.5 榆黄蘑不同生长期半纤维素酶活性的变化

3株榆黄蘑不同生长阶段半纤维素酶活性变化情况见图5。

从图5可以看出，3株榆黄蘑菌种在栽培过程中半纤维素酶活性变化规律基本一致，在菌丝生长阶段半纤维素酶活性均较低，且增长缓慢；随着菌丝满袋和原基形成，培养基中半纤维素酶大量产生，其酶活性快速上升，至一潮菇幼菇期酶活力达到高峰，分别为39.65 U、43.42 U和46.33 U；在幼菇期后酶活性迅速降低，二潮菇原基形成时降至较低，之后又缓慢升高，在二潮菇幼菇期又达到1个小高峰，以后逐渐下降，在采收后1周时酶活性均将至最低，分别为6.34 U、9.17 U和10.54 U。3株菌整个栽培过程中以榆黄蘑29号产生的半纤维素酶活性最高。

2.6 榆黄蘑不同生长期漆酶活性变化

3株榆黄蘑不同生长阶段漆酶活性变化情况见图6。

从图6可以看出，3株榆黄蘑菌种在整个栽培过程中漆酶活性变化规律基本一致，随着栽培时间的延长漆酶活性总体趋势呈逐渐下降。3株菌在菌丝生长至菌袋1/2时测得的酶活性均较高，分别为30.92 U、34.65 U和33.34 U，随着菌丝和子实体生长发育，培养基中的漆酶活力逐渐下降，至二潮菇成熟采收后1周酶活性均降至最低，分别为2.34 U、4.19U和3.54U。其中以榆黄蘑SW06产生的漆酶活性相对最高，其次是榆黄蘑29号。

2.7 榆黄蘑不同生长期过氧化物酶活性的变化

3株榆黄蘑不同生长阶过氧化物酶活性变化情况见图7。

从图7可以看出，3株榆黄蘑菌种在整个栽培过程中，榆黄蘑SW06和榆黄蘑29号的过氧化物酶活性变化规律基本一致，在菌丝生长至菌袋1/2至满袋期间，酶活性缓慢上升至一个小高峰，分别为26.96 U和28.16 U；之后一直呈下降趋势，在幼菇期酶活降至较低，幼菇期至二潮菇现蕾期虽然有缓慢上升，但升高趋势不大，二潮菇现蕾期后酶活性迅速下降，至子实体采收后1周后培养基中的酶活性降至最低，分别为3.62 U和4.85 U；榆黄蘑1号的过氧化物酶活性在菌丝生长期、一潮菇现蕾期和幼菇期一直呈缓慢下降，在幼菇期降至较低峰后又缓慢升高，但升高不明显，之后一直缓慢下降至最低2.01 U。3株榆黄蘑菌种栽培过程中以榆黄蘑29号分泌的过氧化物酶活性相对最高。

3 讨论

测定了3株榆黄蘑菌种不同生长发育阶段培养基滤纸纤维素酶、羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、半纤维素酶、漆酶、过氧化物酶的活性，结果发现这7种胞外酶活性在整个栽培过程中处于动态变化，且不同菌株的酶活性变化有一定的差别。

3株榆黄蘑菌种的滤纸纤维素酶、羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶活性在菌丝生长和子实体形成期都呈上升趋势，至一潮菇幼菇期酶活性都维持在较高水平，主要是用来分解利用基质中的纤维素类、半纤维素类大分子物质，满足子实体生长发育的营养需求；子实体生长发育期碳源营养积累充足，酶活性开始下降，至二潮菇生长发育时积累的营养物质被消耗，为继续分解利用培养基质中纤维素和木质素以满足子实体生长需求，此时诱导产生纤维素类物质水解酶，酶活性又开始呈上升趋势，随着子实体成熟采收，酶活性迅速下降。

淀粉酶是分解利用淀粉类物质的酶类，为转化吸收淀粉类物质，3株榆黄蘑菌种诱导产生了大量的淀粉酶，且栽培过程中淀粉酶活性的变化规律基本一致。栽培前期酶活持续上升，在幼菇期时达到最大，此后培养基中的淀粉类物质被消耗，直至采收结束1周后酶活性降至最低。因此，在栽培培养基内添加适量淀粉类物质有助于提高菌丝活力，可为菌丝生长和子实体发育提供充足的营养，促进子实体产量的提高。

漆酶和过氧化物酶是参与水解木质素的酶类，培养基中的木质素被分解作为主要碳源供榆黄蘑生长发育。本研究表明，3株榆黄蘑栽培过程中漆酶、多酚氧化酶活性变化规律基本一致，菌丝生长初期木质素降解酶活性均较高，此时对基质内的木质素降解利用较快，随着栽培时间的延长基质内的木质素逐渐减少，之后酶活性一直缓慢下降，直至栽培结束酶活性达到最低。