Twinfilin-1基因对H9C2心肌细胞凋亡和增殖的影响

艾克热木·吐尔逊

心肌细胞凋亡、损伤是引起心血管功能异常及相关疾病的重要始动因素之一，其与心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病关系密切[1]。Twinfilin-1(Twf-1)基因是一类细胞骨架调控蛋白，主要参与调控细胞内弹性纤维的长度与排列[2]。在心肌细胞中，细胞骨架不仅参与维持细胞形态，为细胞中细胞器的定位提供支持，并且参与细胞蛋白合成以及营养物质的运输[3-4]。目前研究表明细胞骨架在心肌梗死、心力衰竭、心肌肥厚等心血管疾病过程中发挥了重要作用。探讨心肌细胞中Twf-1基因的表达及其对心肌细胞增殖与凋亡的影响，对于明确心肌细胞凋亡机制具有重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 H9C2心肌细胞购于ATCC(American type culture collection)。

1.1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(GIBCO公司)，TRIZOL、转染试剂质体LTX、PI(Invitrogen公司)，磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液(Sigma公司)，SYBR Premix Ex Taq(TAKARA公司)，CCK8试剂盒(同仁)。Twf-1 RNAi慢病毒、pCXN2-Flag空质粒及 pCXN2-Flag-h Twf-1 过表达质粒均由深圳华大基因化学技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将H9C2 细胞置于含10%胎牛血清FBS的DMEM/F12培养基中，于5%二氧化碳、37 ℃条件下培养。取对数生长期细胞制成细胞悬液，接种于6孔板中，每孔约×105个细胞。

1.2.2 细胞转染 当细胞密度达60%时更换新鲜培养基，分别进行空白对照试剂、阴性慢病毒试剂以及Twf-1 RNAi慢病毒试剂感染。24 h后更换新鲜培养基，并加入嘌呤霉素进行细胞筛选。待荧光显微镜下观察见含绿色荧光标记细胞占细胞总量的80%以上时，将转染Twf-1 RNAi慢病毒的心肌细胞分为3组，分别给予空白试剂、空质粒、过表达Twf-1质粒进行转染，根据细胞转染情况分为空白对照组、阴性对照组、Twf-1沉默组、Twf-1沉默+空质粒组、Twf-1沉默+过表达Twf-1组 5组。细胞转染72 h后即可进行相关细胞生物学行为能力检测。

1.2.3 荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)实验 H9C2细胞总RNA提取按照RNAprepPureMicroKit说明操作，细胞总RNA采用Trizol法，用紫外分光光度仪测定总RNA浓度与纯度，A260/280在1.8～2.0。按照miRNA反转录试剂盒操作说明进行反转录，参照SYBR®Premix Ex Taq TM试剂盒说明进行RT -PCR检测，反应程序：95 ℃10 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，40个循环，所有试验重复3次，采用相对定量分析按照2-△△Ct(实验组)-△△CT(对照组)求出 Twf-1 表达水平。

1.2.4 细胞增殖实验(CCK8) 收集各组转染细胞接种于96孔板中，每孔3 000个，培养箱中常规培养，于72 h向每孔加入10 μL CCK8试剂，培养箱中放置2 h，随后用酶标仪测定其在450 nm处的吸光度(A)值。

1.2.5 细胞凋亡实验(流式细胞术) 分组干预72 h后，将各组细胞培养基分别转移到15 mL的锥形管中并置于冰上。用2 mL PBS 溶液轻轻润洗培养板内细胞，去除PBS溶液，加0.5 mL 0.25%不含EDTA胰酶孵育，直到显微镜下观察到细胞开始从培养板壁脱落。轻轻连续拍打使细胞从培养板壁上完全脱落，将细胞轻轻重悬于预冷缓冲液中制成1×106/mL细胞悬液，取0.5 mL细胞悬液转移至干净离心管内，加入1.25 μL细胞凋亡检测试剂 Annexin V-FITC。室温避光反应15 min后离心，去除上清，将细胞用0.5 mL预冷的结合缓冲液轻悬，加入10 μL PI，立即使用流式细胞仪检测分析。

2 结 果

2.1 H9C2心肌细胞慢病毒感染情况 对慢病毒载体进行荧光蛋白和嘌呤霉素双标记，慢病毒转染48 h后，在荧光显微镜下可见，空白对照组无绿色荧光标记，阴性对照组80%以上细胞有绿色荧光标记，Twf-1沉默组85%以上细胞有绿色荧光标记。详见图1。

图1 H9C2心肌细胞慢病毒感染情况(×100)

2.2 各组心肌细胞Twf-1基因表达水平比较 RT-PCR结果显示，进行慢病毒转染后，与空白对照组和阴性对照组相比，Twf-1沉默组、Twf-1沉默+空质粒组心肌细胞中Twf-1基因的表达水平均明显降低(P<0.05)，Twf-1沉默+过表达Twf-1组心肌细胞中Twf-1基因的表达水平则明显增加，组间差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

与空白对照组比较，＊P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05。

2.3 各组心肌细胞增殖情况比较 CCK8细胞增殖实验结果显示，转染慢病毒后，与空白对照组和阴性对照组相比，Twf-1沉默组、Twf-1沉默+空质粒组心肌细胞增殖效率均明显降低(P<0.05)，Twf-1沉默+过表达Twf-1组心肌细胞增殖效率则明显升高，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。详见图3。

与空白对照组比较，＊P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05。

2.4 各组心肌细胞凋亡率情况比较 流式细胞凋亡实验结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，Twf-1沉默组、Twf-1沉默+空质粒组心肌细胞凋亡率均明显增加(P<0.05)，Twf-1沉默+过表达Twf-1组心肌细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义，且与Twf-1沉默组、Twf-1沉默+空质粒组相比则明显降低，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。详见图4、图5。

与空白对照组比较，＊P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05；与Twf-1沉默组比较， △P<0.05；与Twf-1沉默+空质粒组比较，☆P<0.05。

图5 各组心肌细胞凋亡实验结果分析

3 讨 论

心肌细胞凋亡是引起各种慢性心力衰竭、心脏功能恶化的主要因素之一，心肌细胞凋亡是贯穿整个心血管疾病发病过程的重要环节，寻找抑制心肌细胞凋亡的途径及相关分子作用机制至关重要[5]。

Twf-1基因属于肌动蛋白结合蛋白家族成员之一，在除植物细胞以外的所有真核细胞中普遍存在[6]。Twf-1基因主要参与细胞骨架的重塑，在肌动蛋白纤维的极向生长中发挥着重要的介导作用[7]。作为一个重要的骨架调节蛋白，Twf-1基因不仅与心肌细胞迁移、增殖等动态运动有关，还与某些细胞结构形成以及细胞凋亡等生理病理过程有关。研究指出，Twf-1基因可与某些肌动蛋白单体结合，通过与加帽蛋白的相互作用，参与profilin蛋白的腺苷酸化及聚合反应，由此参与完成肌动蛋白纤维的极向生长[8-9]。研究指出，在细胞骨架重塑过程中，Twf-1基因主要参与调节肌动蛋白单体的动态循环[6，10]。现已有研究明确指出，Twf-1基因与心肌肥大病理生理过程密切相关，但具体作用机制尚未完全明确[11-12]。有文献报道指出，采用siRNA干扰技术沉默Twf-1基因的表达可明显抑制肌动蛋白纤维丝的形成，从而减弱肿瘤细胞向远处迁移的能力，降低瘤细胞的侵袭性，提示Twf-1基因在肿瘤细胞的发生发展中扮演着重要角色[13-14]。

本研究利用siRNA干扰技术，对H9C2心肌细胞中Twf-1基因的表达水平进行了下调，并通过构建相关质粒对H9C2心肌细胞中Twf-1基因进行过表达，实验结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，Twf-1沉默组、Twf-1沉默+空质粒组心肌细胞中Twf-1基因的表达水平明显降低(P<0.05)，Twf-1沉默组、Twf-1沉默+空质粒组心肌细胞增殖率明显降低(P<0.05)，这两组心肌细胞凋亡率则明显增加(P<0.05)。且与空白对照组和阴性对照组相比，Twf-1沉默+过表达Twf-1组心肌细胞中Twf-1基因的表达水平及细胞增殖率也均明显增加(P<0.05)，其心肌细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比无统计学意义，但Twf-1沉默+过表达Twf-1组心肌细胞与Twf-1沉默组、Twf-1沉默+空质粒组相比其凋亡率则明显降低，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。提示siRNA可靶向沉默Twf-1基因，同时抑制心肌细胞增殖，促进心肌细胞凋亡，构建pCXN2-Flag-h Twf-1 过表达质粒则可逆转Twf-1 siRNA对心肌细胞中Twf-1表达水平及相关生物学行为能力的影响。

综上所述，沉默Twf-1基因可抑制H9C2心肌细胞增殖，促进细胞凋亡；过表达Twf-1基因则可促进H9C2心肌细胞增殖，抑制细胞凋亡。后续实验将进一步探究Twf-1具体的上下游靶基因，对心血管疾病潜在治疗靶点Twf-1的具体作用机制进行深入探讨。