利用荧光蛋白示踪脑微血管内皮细胞微丝的动态变化

杜书嵩，赵伟东

（中国医科大学1.生命科学学院发育细胞生物学教研室，教育部医学细胞生物学重点实验室暨卫健委细胞生物学重点实验室，沈阳 110122；2.附属第一医院肛肠外科，沈阳 110001）

肌动蛋白是真核生物细胞骨架微丝的主要组成成分，肌动蛋白单体形式称为球状肌动蛋白，能够聚合成肌动蛋白丝，进而组装形成微丝。肌动蛋白参与多种细胞的生命活动，包括维持细胞形状、细胞运动、细胞分裂、吞噬和细胞内物质运输等［1］。为了对细胞中的肌动蛋白进行观察，目前研究人员常用能够与肌动蛋白丝结合的荧光标记的鬼笔环肽对固定后的细胞进行染色［2］，这样能够在荧光显微镜下观察细胞内肌动蛋白丝的分布和变化。有研究［3］报道，细胞在固定过程中其肌动蛋白结构会受到一定程度的破坏，因此鬼笔环肽染色方法不一定能准确显示肌动蛋白丝的变化。因此，很多学者尝试利用活细胞模型对肌动蛋白进行研究。为了在活细胞中分析肌动蛋白丝的动态变化，有学者通过向细胞内注射微量荧光标记的鬼笔环肽对细胞中的肌动蛋白丝进行标记，也有学者将编码肌动蛋白和绿色荧光蛋白 （green fluorescent protein，GFP） 融合基因的载体转染至细胞内，以实现在活细胞中对肌动蛋白的动态变化进行检测，然而上述方法对活细胞中肌动蛋白的动力学也有一定影响［4］。因此，目前亟需既能对活细胞中的肌动蛋白进行实时观察，又不影响肌动蛋白功能的方法。

脑微血管内皮细胞 （brain microvascular endothelial cell，BMEC） 是组成脑微血管的细胞，也是构成血脑屏障的重要细胞组分。BMEC间存在紧密连接以及黏附连接结构，而肌动蛋白与紧密连接以及黏附连接均有关联。肌动蛋白与ZO蛋白家族 （包括ZO-1、ZO-2、ZO-3） 直接结合，并与紧密连接蛋白闭锁蛋白和闭合蛋白一起维护紧密连接结构，而且肌动蛋白还与连环蛋白结合，参与黏附连接的形成［5］。有研究报道，细胞松弛素处理或缺血缺氧条件下都会导致BMEC肌动蛋白丝解聚，通过破坏BMEC间的连接结构从而导致血脑屏障渗漏［6］。另外，在生理和病理条件下的脑微血管新生过程中，位于新生血管芽末端的BMEC （也称尖端细胞） 会形成由肌动蛋白组成的放射状丝状伪足，用于引导新生血管出芽的方向［7］。因此，肌动蛋白在维护BMEC结构和功能方面发挥重要作用。

Lifeact是从酵母菌中分离的由17个氨基酸组成的短肽，具有稳定结合肌动蛋白丝的特性［8］。本研究构建了GFP标记的Lifeact真核表达载体 （LifeactpEGFP），将其转染至BMEC中，用于在活细胞中观察肌动蛋白的动态变化。结果发现，Lifeact-pEGFP可以有效地标记BMEC中的肌动蛋白丝，并能反映肌动蛋白的动态变化，且对细胞的存活没有明显影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人BMEC为美国约翰·霍普金斯大学医学院KIM博士惠赠。

1.1.2 主要试剂：青霉素-链霉素双抗购自美国Hyclone公司；RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清和胰酶购自美国Gibco公司；Nu血清购自美国BD Biosciences公司；Lipofectamine 2000和鬼笔环肽购自美国Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建和鉴定：以pEGFP-N1为载体，选择多克隆位点中的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点，以无缝克隆方法，把Lifeact的编码序列克隆至pEGFP-N1载体中；然后提取重组质粒，以限制性内切酶BamHⅠ进行酶切反应，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶电泳成像系统对酶切结果进行分析。

1.2.2 细胞培养：BMEC培养于含10%胎牛血清、10%Nu血清的RPMI 1640培养液，置于37 ℃、5%CO2、100%湿度的细胞培养箱中培养，每2～3 d更换新鲜培养液。

1.2.3 细胞转染：将BMEC以1×106/孔接种于6孔板，待细胞密度达到70%～80%时进行转染。转染前1 h更换RPMI 1640培养基，将Lipofectamine 2000与Lifeact-pEGFP质粒或pEGFP-N1载体质粒按一定比例混合后转染细胞，转染5 h后，更换为含血清的培养基继续培养。

1.2.4 细胞增殖实验：将BMEC分为2组，分别转染Lifeact-pEGFP质粒和pEGFP-N1空载体质粒，消化并接种在96孔板中，2×103/孔，体积为100 μL，每组设3个复孔。分别在24、48、72和96 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱孵育1 h，随后采用酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.2.5 免疫荧光染色：将BMEC分为2组，分别转染Lifeact-pEGFP质粒和pEGFP-N1空载体，24 h后 用PBS洗3次，随后用4%甲醛于室温固定30 min。固定后的细胞用PBS洗3次，每次5 min。加入0.1% Triton X-100处理5 min，细胞用PBS洗3次，用5%牛血清白蛋白于室温封闭30 min。加入1 ∶1 000稀释的罗丹明标记的鬼笔环肽，避光孵育1 h。PBS洗3次，用封片剂封片，以共聚焦激光扫描显微镜 （型号Ti2，日本Nikon公司） 观察并采集图像。

1.2.6 细胞伸展实验：为了实时评估细胞黏附伸展情况，将转染的BMEC消化后接种于玻璃底面的共聚焦专用直径35 mm细胞培养皿中，并将其置于安装在显微镜载物台上的37 ℃培养小室中，每30 s成像1次，以倒置共聚焦激光扫描显微镜成像60 min。成像过程中以细胞初始位置为中心，观察细胞向外周的伸展情况。

1.2.7 细胞划痕实验：将BMEC接种于玻璃底细胞培养皿中，于转染质粒后24 h，用无菌吸头在长满细胞的培养皿上均匀地划一道直线。用PBS洗细胞3次，加入无血清培养基，置于安装在显微镜载物台上的37 ℃培养小室中，设定拍摄间隔60 s，累计成像60 min。共聚焦显微镜成像过程中以细胞初始位置为中心，观察细胞向划痕方向的迁移情况。

1.3 统计学分析

实验至少重复3次，使用GraphPad Prism 6软件对数据进行统计学分析。2组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Lifeact-pEGFP质粒的构建和鉴定

利用pEGFP-N1载体的多克隆位点中的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点，把Lifeact的编码序列 （54 bp）克隆至载体中，获得重组质粒Lifeact-pEGFP （4 754 bp） 后，将质粒DNA以BamHⅠ进行酶切，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，利用紫外凝胶电泳成像系统拍照记录，在5 000 bp处可见清晰DNA条带 （图1A）。将Lifeact-pEGFP质粒进行DNA测序分析，发现插入序列与酵母的Lifeact的序列一致 （图1B），说明Lifeact-pEGFP重组质粒构建成功。

图1 Lifeact-pEGFP质粒的鉴定Fig.1 Identification of the recombinant Lifeact-pEGFP construct

2.2 Lifeact-pEGFP的表达不影响BMEC的存活

为了探讨Lifeact-pEGFP重组质粒的表达是否对BMEC存活产生影响，在BMEC转染Lifeact-pEGFP质粒和pEGFP-N1空载体质粒后24、48、72、96 h，利用CCK-8试剂进行检测，判断活细胞的数量。与转染pEGFP-N1载体质粒的BMEC相比，转染LifeactpEGFP后的BMEC在各个时间点的存活水平没有明显变化，无统计学差异 （P> 0.05），见图2。说明LifeactpEGFP质粒转染至BMEC后，表达产生的LifeactpEGFP融合蛋白对细胞的存活没有明显影响，可以进行后续实验研究。

2.3 BMEC中表达的Lifeact-pEGFP与肌动蛋白丝呈共定位

图2 Lifeact-pEGFP质粒表达对BMEC存活的影响Fig.2 Survival of BMECs transfected with Lifeact-pEGFP

为了分析在BMEC中表达的Lifeact-pEGFP与肌动蛋白的相关性，分别将转染pEGFP-N1空载体质粒和Lifeact-pEGFP质粒的BMEC固定后以红色荧光标记的鬼笔环肽进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察。结果发现，Lifeact-pEGFP的绿色荧光信号与鬼笔环肽的红色荧光信号位置分布一致，而pEGFP-N1空载体无上述分布特点 （图3A、3C）。进一步对图3A和3C中白色虚线位置进行双通道荧光谱线分析，结果显示，pEGFP-N1空载体质粒与鬼笔环肽信号无共定位，Lifeact-pEGFP与鬼笔环肽的荧光信号呈明显共定位 （图3B、3D）。以上结果显示，Lifeact-pEGFP质粒转染BMEC后表达的Lifeact-pEGFP融合蛋白能够显示BMEC中的肌动蛋白丝，主要表现为分布于胞质内的应力纤维，以及分布于细胞边缘的皮质纤维，而细胞核区域的肌动蛋白丝则很少，这与鬼笔环肽染色标记的肌动蛋白丝一致，即利用Lifeact-pEGFP质粒转染方法可以对BMEC中的肌动蛋白丝进行标记。

图3 BMEC中表达的Lifeact-pEGFP能够标记肌动蛋白丝Fig.3 Localization of F-actin in BMECs by the expression of Lifeact-pEGFP

2.4 Lifeact-pEGFP的表达可以显示BMEC在伸展过程中肌动蛋白丝的动态变化

为了分析Lifeact-pEGFP是否可以用来检测肌动蛋白的动态变化，将转染Lifeact-pEGFP质粒的BMEC消化后重新接种于培养皿中，置于37 ℃的培养条件下继续培养，此时可以观察到细胞从悬浮至贴壁的整个过程，即细胞伸展，同时利用激光共聚焦显微镜对活细胞和GFP荧光信号进行连续观察。结果发现，在细胞逐渐伸展的过程中，肌动蛋白丝主要分布于细胞边缘，对荧光信号的分布进行分析发现，Lifeact-pEGFP主要分布于细胞外周皮质区 （图4A、4B）。BMEC伸展时，在细胞外周皮质区形成片状伪足和丝状伪足的结构，且片状伪足和丝状伪足内的Lifeact-pEGFP标记的肌动蛋白丝并不是恒定不变，而是呈现出高度动态的变化 （图4A）。在细胞伸展早期，肌动蛋白丝均匀分布于细胞皮质区并参与形成较多丝状伪足；在细胞伸展的晚期，随着细胞面积逐渐增大，肌动蛋白丝的分布出现极性分布，细胞形态也由圆形逐渐转变为扇形或梭形。细胞面积的测量结果显示，随着时间的进展，BMEC的面积逐渐增大，在60 min内呈线性增长趋势 （图4C）。以上结果表明，转染Lifeact-pEGFP可以用来分析细胞伸展时肌动蛋白丝的动态变化。

2.5 Lifeact-pEGFP能够标记运动细胞前导缘肌动蛋白丝的动态变化

为了分析Lifeact-pEGFP是否可以用来检测细胞迁移时肌动蛋白的动态变化，将转染LifeactpEGFP质粒的BMEC消化后重新接种于玻璃底培养皿中，继续培养，待细胞接近长满时进行划痕实验。然后在37 ℃的培养小室中以激光共聚焦显微镜对活细胞和GFP的荧光信号进行连续观察，主要关注向划痕区域逐渐移动的单个细胞。结果发现，在BMEC逐渐向划痕区迁移的过程中，Lifeact-pEGFP显示的肌动蛋白丝主要分布于细胞的前导缘 （即朝向划痕方向的细胞边缘），且构成前导缘的片状伪足内的肌动蛋白丝呈高度动态的变化 （图5A、5B）。以上结果显示，转染Lifeact-pEGFP可以用来分析BMEC迁移时前导缘肌动蛋白丝的动态变化。

3 讨论

图4 BMEC在贴壁伸展过程中Lifeact-pEGFP标记的肌动蛋白丝的变化Fig.4 Changes of Lifeact-pEGFP labeled F-actin in BMECs during cell spreading

图5 转染Lifeact-pEGFP后可以标记细胞迁移过程中BMEC肌动蛋白丝的变化Fig.5 F-actin dynamics in migrating BMECs indicated by the expression of Lifeact-pEGFP

Lifeact是在酵母菌中发现的一种含有17个氨基酸的短肽，具有稳定结合肌动蛋白丝的特性［8-9］。本研究构建了GFP标记Lifeact的真核表达载体即Lifeact-pEGFP，并成功将Lifeact-pEGFP质粒转染至人BMEC中。细胞存活实验结果显示，转染LifeactpEGFP后BMEC存活未受到影响，因此在细胞转染Lifeact-pEGFP质粒后，可以在活细胞水平进行长时间实时检测，从而可以观察细胞伸展和迁移过程中肌动蛋白丝的动态变化，在BMEC活细胞中实现对肌动蛋白丝的可视化研究，为研究血管内皮细胞中肌动蛋白丝的动态变化提供了直观高效的手段。

肌动蛋白丝在BMEC中主要呈现为横贯细胞的聚集而成的应力纤维，以及沿着细胞边缘聚集形成的皮质纤维。在Lifeact-pEGFP转染的BMEC中，细胞中的GFP荧光信号能够反映应力纤维和皮质纤维的分布，且与鬼笔环肽染色的信号能够实现明显的共定位，这说明Lifeact-pEGFP融合蛋白能够与肌动蛋白丝直接结合，从而能够反映肌动蛋白丝分布的部位。而且，Lifeact-pEGFP荧光信号的强弱还能用来判断肌动蛋白的聚合程度，即在有较多肌动蛋白分子聚集的部位，其能够结合的Lifeact-pEGFP也较多，因此荧光信号也较强；反之则较弱。

细胞在迁移过程中形态出现明显变化，朝向细胞迁移方向的细胞边缘称为前导缘，是决定细胞迁移的关键结构［10］。本研究显示，Lifeact-pEGFP在正常培养的BMEC中主要以应力纤维和皮质纤维的形式呈现，在细胞中央和细胞周边均有分布；然而，在迁移的BME中，Lifeact-pEGFP主要分布于前导缘，说明细胞迁移过程中肌动蛋白单体发生了重新分布，形成应力纤维和皮质纤维的肌动蛋白丝发生了解聚，解聚后的肌动蛋白单体则在前导缘重新组装。研究［11-12］显示，导致肌动蛋白组装的上游因子主要是Wiskott-Aldrich综合征蛋白和Wiskott-Aldrich Verprolin蛋白被激活后引起的肌动蛋白相关蛋白2/3复合体的活化，从而使新的肌动蛋白丝在与原有肌动蛋白丝呈70°的方向延长，推动前导缘向前移动。

需要指出的是，也有研究［13］报道过表达Lifeact-GFP能够使coffilin与肌动蛋白的结合增多，从而对肌动蛋白丝的组装有一定的抑制效应。因此，笔者建议在实际进行Lifeact-pEGFP质粒转染细胞的实验时，转染质粒的剂量不应过多。