丹参酮ⅡA通过5-脂氧酶/白三烯通路治疗动脉粥样硬化的作用机制研究

何德全，陈友权

动脉粥样硬化(AS)在我国中老年居民中呈高发态势，严重影响病人的生活质量，威胁病人生命健康[1]。AS发病缓慢且病因复杂，与脂质浸润、血管内皮损伤、血小板聚集、炎性细胞浸润、血栓形成等多种因素密切相关[2]。AS不仅仅是动脉壁脂质堆积，它更是病理状态下的固有免疫和适应性免疫介导的慢性炎性疾病[3]。白三烯(1eukotriene， LTs)是一种重要的炎症介质，它是花生四烯酸的代谢产物[4]，5-脂氧酶 (5-LO)是催化花生四烯酸(AA)转化成白三烯的关键酶[5]。目前国外已有研究表明，白三烯在动脉粥样斑块组织、晚期斑块和软斑块处表达异常丰富，说明白三烯与AS关系密切，而国内则较少涉及此类研究。丹参酮ⅡA磺酸钠是从植物丹参中分离的二萜醌类化合物丹参酮ⅡA， 经磺化而得到的水溶性物质，具有抗血小板聚集、抗自由基损害等作用[6]。现代医学和药理学研究表明，丹参酮ⅡA具有抗心肌缺血、抗AS、增加冠状动脉血流量、抗心律失常、抗菌、抗炎和抗肿瘤等作用[7]。本实验拟通过建立大鼠AS模型，证实5-LO/白三烯在AS中的异常表达，由此探讨丹参酮ⅡA通过5-LO/白三烯通路对AS的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料 体质量180～220 g的SD大鼠45只，购自中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司。酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购于美国BOSTER公司。逆转录试剂盒购自Promega公司。TB GreenTM Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自TakaRa公司。5-LO、白三烯A4H(LTA4H)、白三烯B4(LTB4)和GAPDH抗体和山羊抗兔(鼠)IgG二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。PVDF膜购自Millipore公司。苏木精-伊红(HE)试剂盒和免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 动物造模与分组 将45只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分成对照组、AS模型组和丹参酮ⅡA组，每组15只。除对照组外，AS模型组和丹参酮ⅡA组大鼠均通过喂养高脂胆固醇(1.25%胆固醇和21%脂肪)饲料结合腹腔注射维生素D3的方法建立大鼠AS模型，共12周。同时丹参酮ⅡA组大鼠按照100 mg/(kg·d) 剂量在造模过程中同步连续灌胃给药12周，对照组和AS模型组则同步给予等体积生理盐水。

1.2.2 HE染色观察腹主动脉内膜病理表现情况 12周末，随机选取5只大鼠，予25%乌拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉后快速分离腹主动脉，取1 cm长腹主动脉，生理盐水冲洗后置于10%中性甲醛溶液中固定，经HE染色观察病理表现。剩余血管置入冻存管，-80 ℃保存备用。

1.2.3 检测血清中血脂含量变化 12周末，随机选取5只大鼠，予25%乌拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉后于心尖部采血，1 500 r/min离心，10 min后取血清，通过全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平。

1.2.4 ELISA检测5-LO、LTB4和白三烯C4(LTC4)和LTA4H含量变化 12周末，随机选取5只大鼠，予25%乌拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉后于心尖部采血置促凝管中，待凝固后以3 000 r/min离心15 min，分离血清于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA试剂盒测定各组大鼠所采集血清中5-LO、LTB4和LTC4含量。

1.2.5 免疫组化法测定腹主动脉中5-LO阳性表达情况 腹主动脉经固定、包埋、石蜡切片、脱水、缓冲液清洗，3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，滴加非免疫动物血清20 min，滴加一抗，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗，滴加二抗，冲洗后加ABC复合物，DAB显色，在400倍显微镜下观察，用MIAS图像分析系统分析，按照免疫组化染色阳性细胞数在每一高倍视野中所占比例依次统计。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测 使用TRIzol试剂提取大鼠主动脉总RNA，用Nanodrop 2000 仪器检测样品RNA浓度。然后按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA。按照qPCR试剂盒说明书配置相应的体系，每组设置3个复孔。使用TB GreenTM Premix Ex Taq II试剂盒进行qPCR。qPCR的条件如下：95 ℃ 30 s (1循环)，95 ℃5 s、60 ℃30 s(40循环)。使用StepOnePlus 仪器完成实验后，采用2-△△Ct法分析数据。实验独立重复3次。其中使用的引物见表1。

1.2.7 蛋白质印迹法(Western Blot)检测 取大鼠腹主动脉组织(100 mg)样本加入1 mL制备好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法测定总蛋白含量。取等量蛋白质样品上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质后转膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，之后加入稀释后的5-LO、LTB4、LTA4H和GAPDH一抗，4 ℃摇床上孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次10 mim，加入对应于一抗种属来源的HRP标记的二抗，在室温摇床上孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化学发光液显色发光，凝胶成像系统拍照，Image Pro Plus图像分析系统对蛋白条带进行分析。

2 结 果

2.1 大鼠腹主动脉组织结构改变分析 与对照组比较，AS模型组大鼠腹主动脉内皮细胞破坏，出现明显的钙化及炎细胞浸润，平滑肌细胞增殖、萎缩，弹力纤维断裂，为典型AS病理变化，表明AS造模成功。详见图1。

图1 HE染色观察对照组与AS模型组大鼠腹主动脉的组织结构 (×200)

2.2 丹参酮ⅡA对大鼠血清中TC、TG、LDL和HDL含量的影响 与对照组比较，AS模型组大鼠血液中TC、TG和LDL含量均增加(P<0.05)，HDL含量增加(P<0.05)；与AS模型组比较，丹参酮ⅡA组大鼠血液中TC、TG和LDL含量均减少(P<0.05)，HDL含量减少(P<0.05)。详见表2。

表2 3组大鼠血清中TC、TG、LDL和HDL的含量变化 (±s) 单位： mmol/L

2.3 丹参酮ⅡA对大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量的影响 与对照组比较，AS模型组大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量均增加(P<0.05)；与AS模型组比较，丹参酮ⅡA组大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量均减少(P<0.05)。详见表3。

表3 3组大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4的含量变化 (±s) 单位： ng/L

2.4 丹参酮ⅡA对大鼠主动脉中5-LO、LTA4H和LTB4蛋白及mRNA表达的影响 与对照组比较，AS模型组大鼠主动脉中5-LO、LTA4H和LTB4 mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05)；与AS模型组比较，丹参酮ⅡA组大鼠主动脉中5-LO、LTA4H和LTB4 mRNA及蛋白表达均下调(P<0.05)。详见图2、图3。

与对照组比较，＊P<0.05；与AS模型组比较，#P<0.05。

与对照组比较，＊P<0.05；与AS模型组比较，#P<0.05。

2.5 丹参酮ⅡA对大鼠腹主动脉中5-LO阳性表达的影响 对照组动脉管壁均匀，为淡蓝色浅染；AS模型组动脉管壁周围棕黄色深染；丹参酮ⅡA组管壁内膜脂质浸润较AS模型组轻。详见图4。

图4 免疫组化法测定大鼠主动脉中5-LO阳性表达情况(×400)

3 讨 论

AS指在动脉及其分支血管壁内膜发生脂质沉积，且平滑肌细胞大量增殖并向内膜迁移，从而导致内膜增厚并最终形成粥样病灶[8]。AS是一个复杂的病理过程，发病机制极其复杂，炎症反应在AS的发生发展中发挥着重要作用[9]。目前，越来越多的证据表明，AS是一种炎症和免疫性疾病。

白三烯是一种强烈的脂质促炎因子，其产物LTB4是体内重要的炎症介质，LTB4可刺激多种细胞因子的产生，其产生主要受5-LO和LTA4H的影响[10]。5-LO是炎症反应中的关键酶，广泛分布于机体内，静息状态下5-LO主要分布在细胞质和核浆中，不合成白三烯[11]；当受到病理刺激时，5-LO催化花生四烯酸转化成生成LTA4，LTA4被LTA4H进一步转化为LTB4或者经相关酶生成LTC4[12]。马海英等[13]研究表明：白三烯在哮喘、类风湿关节炎、炎症性肠病等疾病中发挥着至关重要的作用，同时白三烯参与了AS血管重塑，是动脉硬化的机制之一。

丹参酮ⅡA是丹参中脂溶性松香烷型二萜类化合物，是丹参根部的主要提取物，具有抗癌、抗菌、抗病毒等临床药理作用，受到医药学家的高度关注[14]。研究发现，丹参酮ⅡA能显著降低AS小鼠血清TG、TC、LDL浓度，表现出明显的抗AS作用[15]。因此，丹参酮ⅡA在抗AS方面发挥着重要作用。

本实验结果表明，与对照组比较，AS模型组大鼠腹主动脉出现明显的AS病理变化，表明AS造模成功。与对照组比较，AS模型组大鼠血液中TC、TG和LDL含量均增加(P<0.05)，HDL含量减少(P<0.05)，与AS模型组比较，丹参酮ⅡA组大鼠血液中TC、TG和LDL含量均减少(P<0.05)，HDL含量增加(P<0.05)，表明丹参酮ⅡA能降低AS模型组大鼠的血脂含量，减轻AS的病理症状。与对照组比较，AS模型组大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量均增加(P<0.01)，与AS模型组比较，丹参酮ⅡA组大鼠血清中5-LO、LTB4和LTC4含量均减少(P<0.05)；与对照组比较，AS模型组大鼠主动脉中5-LO、LTA4H和LTB4 mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05)，与AS模型组比较，丹参酮ⅡA组大鼠主动脉中5-LO、LTA4H和LTB4 mRNA及蛋白表达均下调；对照组动脉管壁均匀，为淡蓝色浅染，AS模型组动脉管壁周围棕黄色深染，丹参酮

ⅡA组管壁内膜脂质浸润较AS模型组轻，以上实验结果表明，丹参酮ⅡA能抑制5-LO/白三烯通路的活性，对AS有治疗作用。

综上所述，5-LO/白三烯与AS关系密切，其有可能是潜在的药物治疗AS的重要干预靶点，以抑制这一通路为目标将有望研制出疗效更加显著的治疗AS的药物。