基于一测多评法的丹参酮提取物质量控制△

郭龙，薛紫鲸，刘爱朋，张丹，郑玉光*

1.河北中医学院 药学院，河北 石家庄 050200；2.河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050200

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，味苦，微寒，归心、肝经。丹参具有通经止痛、活血祛瘀、清心除烦、凉血消痈等功效，用于胸痹心痛、症瘕积聚、热痹疼痛、心烦不眠、月经不调、痛经经闭、疮疡肿痛[1]。丹参中的化学成分根据极性差异可以分为脂溶性成分和水溶性成分。脂溶性成分主要为丹参酮类化合物，如丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I和二氢丹参酮I等；水溶性成分主要为酚酸类化合物，如丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸C等[2-3]。

丹参酮提取物为丹参的干燥根及根茎加工制成的提取物，主要含有脂溶性的丹参酮类成分[1，4]，收载于《中华人民共和国药典》(2015版)。研究表明，丹参酮提取物具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等多方面的药理活性，临床中主要用于心脑血管疾病的治疗[5-7]。丹参酮提取物主要含有脂溶性的丹参酮类成分，丹参酮类成分结构相似、种类众多，导致丹参酮提取物质量控制较为困难。已有报道采用高效液相色谱法，以丹参酮IIA和隐丹参酮等成分为指标，对丹参酮提取物质量进行评价[8-9]，但这些方法存在着指标成分过少，对照品消耗量大，操作复杂等缺陷。《中华人民共和国药典》中以丹参酮IIA和隐丹参酮作为定性和定量指标对丹参酮提取物进行质量控制，但除了上述有效成分之外，尚需建立更多活性成分如丹参酮I、二氢丹参酮I等的定量分析方法，以期对丹参酮提取物的质量标准进行提高与完善。

中药及其制剂具有“多成分、多靶点、整合作用”特点，决定了任何单一成分都难以准确表达中药及其制剂的整体质量，因此，多指标综合质量控制模式成为中药质量评价的发展趋势[10-11]。但是，在实际工作中，标准品获得的困难、单体不稳定或价格昂贵等问题成为了限制中药多指标质量控制方法建立与推广应用的主要技术瓶颈。一测多评方法利用药材各有效成分内在函数关系和比例关系，达到测定一个易得标准品的含量，来实现多个成分含量同时测定的目的，可以较好解决标准品不易获得的难题，在中药及其制剂多成分、多指标质量控制中有广泛应用[12]。

综上所述，本研究拟采用一测多评方法，建立丹参酮提取物中4种丹参酮类成分(丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I和二氢丹参酮I)的含量测定方法，以期为丹参酮提取多成分含量测定提供新方法，为丹参酮提取物的质量控制提供更科学、更准确的评价模式。

1 材料

Aglient 1290液相色谱仪、Aglient 1260液相色谱仪(四元泵、DAD检测器)；Shimadzu LC-20液相色谱仪(二元泵、紫外检测器)；色谱柱：Aglient Extend C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Therom BDS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Inerisil ODS-SP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Mettler-Toledo XS205 DU型电子分析天平；KS-5200B超声波清洗仪(昆山洁立美超声仪器有限公司)。

二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA(成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-17032705、MUST-17030403、MUST-17030210、MUST-17022502)经高效液相色谱检测，纯度均大于98%(图1)。丹参酮提取物(TE1～TE3)购自于陕西天之润生物科技有限公司。乙腈和甲酸(ROE公司，色谱级)；去离子水用Milli-Q系统制备；其他试剂均为分析纯。

注：1.二氢丹参酮I；2.隐丹参酮；3.丹参酮I；4.丹参酮IIA。图1 二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的化学结构式

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱分离采用Agilent Extend C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；流速：0.8 mL·min-1；柱温：25 ℃；梯度洗脱，洗脱程序：0～10 min，60%B；10～40 min，60%～80%B，保持80%B运行5 min后，回到起始梯度，每次进样前以初始梯度平衡10 min；检测波长270 nm。上述色谱条件下，二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA 4个丹参酮类成分的分离度良好，色谱图见图2。

注：A.混合对照品；B.丹参酮提取物样品；1.二氢丹参酮I；2.隐丹参酮；3.丹参酮I；4.丹参酮IIA。图2 混合对照品和丹参酮提取物样品HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取二氢丹参酮I 1.74 mg、隐丹参酮2.53 mg、丹参酮I 1.82 mg、丹参酮IIA 1.95 mg至25 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成含二氢丹参酮I 69.6 mg·L-1、隐丹参酮101.2 mg·L-1、丹参酮I 72.8 mg·L-1、丹参酮IIA 78 mg·L-1的混合对照品溶液，置于4 ℃备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取丹参酮提取物粉末5 mg，加入1 mL甲醇，100 kHz超声提取30 min，室温下冷却，加甲醇补足减少的质量后，13 000 r·min-1离心10 min，取上清，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、定量限及检测限 将混合对照品溶液用甲醇稀释成一系列的梯度浓度溶液后，按2.1项下色谱条件进样分析，以待测化合物峰面积对浓度进行线性回归，得到各成分标准曲线。在定量范围内各化合物的线性良好(r>0.999 7)，另以适宜浓度的标准品溶液逐级稀释后进样分析，分别测定各待测成分信噪比(S/N为10和3时的浓度计为定量限和检测限)，结果见表1。

2.4.2 精密度试验 分别考察所建立的分析方法的日内精密度和日间精密度。取丹参酮提取物样品(TE1)，按2.3项下制备样品，在一天内连续进样6针，记录各个化合物的峰面积，计算RSD，考察日内精密度；将上述样品连续3 d每天进样3针，RSD，考察日间精密度。结果显示，二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的日内精密度分别为0.45%、0.64%、0.50%、0.57%，日间精密度为0.92%、0.55%、0.43%、0.48%。由日内、日间精密度考察结果可知，所建立分析方法的精密度良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取丹参酮提取物(TE1)样品粉末6份，每份5 mg，按2.3项下方法平行制备供试品溶液。计算各化合物的含量，并计算测定结果的RSD。二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的RSD分别为0.75%、0.95%、0.87%、0.91%，结果表明所建立的分析方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取丹参酮提取物(TE1)供试品溶液，于供试品溶液制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，记录各化合物的峰面积并计算RSD，结果显示，二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA峰面积的RSD分别为0.82%、0.87%、1.68%、0.18%。结果表明，所测定的4个丹参酮类成分在24 h内稳定性较好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称定已知含量的丹参酮提取物(TE1)粉末5 mg，平行9份，分别加入4个丹参酮化合物对照品适量(高、中、低浓度各3份)，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样分析，记录各化合物的峰面积，计算各成分的含量。根据以下公式计算回收率。

(1)

4个丹参酮成分的加样回收率试验结果见表2。二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的平均加样回收率分别为100.67%、99.66%、100.82%、100.02%，RSD分别为3.49%、2.21%、2.93%、3.35%。加样回收率结果表明，所建立的分析方法准确性良好。

表1 4种丹参酮类成分的回归方程、相关系数、线性范围、定量限和检测限 mg·L-1

表2 4种丹参酮类成分加样回收率试验结果(n=3)

2.5 一测多评方法的建立

2.5.1 相对校正因子和相对保留时间的计算 化合物在一定范围内(线性范围)成分的量(浓度)与紫外检测器响应成正比，在中药多指标质量评价时，选取其中对照品易得、药材中含量较高且稳定的一个成分作为内标物，建立该内标物与其他待测成分之间的相对校正因子(RF)；在实际测定时，用外标法测定内标物的含量，再通过相对校正因子计算其他待测组分的含量，从而实现只用一个对照品(内标物)，实现多个待测组分的含量测定[13]。

本实验中以丹参酮IIA为内标物，对丹参酮类化合物建立一测多评分析方法，各化合物的相对校正因子(RFX)根据以下公式计算：

(2)

其中Csi和Cxi分别表示内标化合物和待测化合物的质量分数(mg·g-1)，Rsi和Rxi表示内标化合物和待测化合物在对应浓度下的响应值，i为不同浓度梯度，每个化合物均在7个不同浓度下测试并计算，即n=7。

化合物的相对保留时间(RRT)可以用于样品色谱图中峰的标定和指认。化合物相对保留时间(RRTX)根据以下公式计算：

RRTX=RTX/RTS

(3)

其中RTX为待测化合物的保留时间(min)，RTS为内标化合物的保留时间(min)。

以丹参酮IIA为内标物，根据以上公式计算得二氢丹参酮I、隐丹参酮和丹参酮I的相对校正因子分别为1.55、1.12、1.28，相对保留时间分别为0.44、0.65、0.70。

2.5.2 系统耐用性考察 为了考察所建立一测多评方法的系统耐用性，针对不同色谱柱、不同色谱仪器、不同流速和不同柱温等方面考察不同因素对于各化合物相对校正因子和相对保留时间的影响[14]。

不同仪器和不同色谱柱对RF和RRT的影响：选取3种色谱柱(Aglient Extend C18色谱柱、Therom BDS C18色谱柱和Inerisil ODS-SP色谱柱)和3种液相色谱系统(Aglient 1260液相色谱系统、Aglient 1290液相色谱系统和Shimadzu LC-20液相色谱系统)对各丹参酮化合物的RF和RRT进行了考察。结果表明(表3)，二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I的RF和RRT的RSD分别在2%～5%，表明所建立的一测多评方法具有良好的重复性和适应性。

不同流速对RF和RRT的影响：采用Aglient 1260液相色谱系统和Agilent Extend C18色谱柱分别在不同流速(0.8、0.9、1、1.2 mL·min-1)下测定各化合物的RF和RRT。结果表明(表4)，在不同流速下二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I的RF和RRT重复性良好，RSD分别在0.64%～1.11%和1.90%～3.27%。

不同柱温对RF和RRT的影响：采用Aglient 1260液相色谱系统和Agilent Extend C18色谱柱在不同柱温(20、25、30 ℃)下测定各化合物的RF和RRT。结果显示(表5)，不同柱温对二氢丹参酮I、隐丹参酮和丹参酮I的RF和RRT影响较小，RSD分别在0.52%～0.98%和1.45%～2.44%。

由系统耐用性考察结果可知，二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I的RF和RRT受不同的色谱柱、不同液相色谱系统、不同流速和不同柱温等因素的影响较小，所建立的一测多评方法系统耐用性良好。

表3 不同仪器和不同色谱柱测得的相对校正因子和相对保留时间

表4 不同流速下测得的相对校正因子和相对保留时间

表5 不同柱温下测得的相对校正因子和相对保留时间

2.6 一测多评法与外标法含量测定结果比较

经方法学优化和考察后，采用以上建立的一测多评方法，对3批丹参酮提取物(TE1～TE3)中的二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA 4个活性丹参酮类成分的含量进行了测定。按照2.3项下方法制备丹参酮提取物样品溶液，按2.1项下色谱条件进行分析，分别测定二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的含量(图2)。3批丹参酮提取物含量测定结果见表6，丹参酮类成分的总含量分别为23.64%、19.54%和19.14%。3批丹参酮提取物中，丹参酮IIA的含量均最高，分别为10.75%、10.79%和10.48%。

为了考察一测多评方法的准确性，把一测多评法(SSDMC)的测定结果与外标法(ESM)测定结果进行了比较。以准确度(Accuracy)来评价所建立的一测多评方法的可行性，准确度由以下公式计算：

准确度(%)=CS/CE×100%

(4)

其中，CS表示一测多评法计算所得的含量，CE表示通过外标法计算所得的含量。

为了考察一测多评法的准确性，比较了外标法和一测多评法的测定结果。采用一测多评法和传统外标法所测得的各成分的含量结果基本一致，通过t检验对两种方法测得的含量结果进行统计学分析，结果显示，差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果表明，以丹参酮IIA为内标物建立的一测多评方法具有较好的准确性和可行性，测定结果准确可靠，可以用于丹参酮提取物的质量控制。

表6 丹参酮提取物中4种丹参酮类成分一测多评法和外标法含量测定结果(n=3) %

3 讨论

在中药多成分一测多评方法建立中，一般选取对照品易得、药材中含量较高且稳定的成分作为内标物。丹参酮IIA具有抗炎、抗氧化、抗心肌缺血、抗肿瘤等多种药理活性，是丹参酮提取物中的主要活性成分之一[15]。丹参酮IIA对照品相对价廉易得，稳定性较好，且在丹参酮提取物中含量较高，因此本实验中选择丹参酮IIA为内标物，建立丹参酮提取物中4个主要活性丹参酮类成分的一测多评方法，用于丹参酮提取物的质量控制。

为了确定一测多评方法的检测波长，采用DAD检测器对4个丹参酮类化合物进行全波长扫描，各化合物的紫外吸收光谱见图3。由结果可知，二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮和丹参酮IIA最大吸收波长分别为240、245、265、270 nm。因为实验中选择丹参酮IIA为内标化合物，因此将检测波长设为其最大吸收波长270 nm。

为了获得最好的色谱分离效果，分别对流速(0.8、0.9、1.0、1.2 mL·min-1)、柱温(20、25、30 ℃)及流动性pH(纯水和0.1%甲酸)进行了考察。最终确定最优色谱条件为0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速0.8 mL·min-1；柱温30 ℃。

本实验中考察不同仪器、不同色谱柱、不同流速和不同柱温等因素对相对校正因子和相对保留时间的影响，结果表明，不同仪器、不同色谱柱、不同流速和不同柱温下测得各丹参酮类成分的相对校正因子和相对保留时间基本一致，相对校正因子的RSD小于2%，相对保留时间的RSD小于5%，说明所建立的一测多评方法系统耐用性良好，可用于丹参酮提取物中4个丹参酮类成分的含量测定。

采用所建立的一测多评方法，以丹参酮IIA为内标物对3批丹参酮提取物的二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA4个丹参酮类成分的含量进行了测定，结果表明，3批丹参酮提取物之间的质量基本一致，差异不明显。4个活性丹参酮类成分的总含量在19%～24%。为了进一步考察所建立的一测多评方法的准确性，将一测多评法的测定结果与外标法测定结果进行了比较，结果表明，两种方法测定的结果基本一致，提示所建立的一测多评方法准确度和可靠性良好，可用于丹参酮提取物的多成分含量测定及质量控制。

注：A.二氢丹参酮I；B.隐丹参酮；C.丹参酮I；D.丹参酮IIA。图3 二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的紫外光谱图

综上所述，本实验建立了以丹参酮IIA为内标物的丹参酮提取物的一测多评法，同时测定了丹参酮提取物中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量。所建立的方法具有较好的重复性、稳定性和准确度，可用于丹参酮提取物的多成分含量测定及质量控制。本研究提升了中华人民共和国药典中丹参酮提取物的质量控制标准，为其进一步应用和推广提供了技术支撑。一测多评法作为一种全新的多指标质量评价模式，有助于解决中药多成分质量控制中对照品匮乏的瓶颈问题，实际运用具有较高的可行性、可推广性。