金银花组织培养外植体灭菌方法的研究

韩笑，王娜，张玲，李佳

山东中医药大学，山东 济南 250355

金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb的干燥花蕾或带初开的花[1]，富含酚酸类、环烯醚萜类、黄酮类、糖类挥发油类及微量元素等多种成分，有抑菌抗炎，抗氧化等多种生理活性，有清热解毒、治疗热毒血痢、痈疽疔毒的功效[2-3]。由于忍冬繁殖能力强，对土壤和气候的选择并不严格，全国各地均有种植，且以河南的“密银花”和山东的“济银花”最为出名。目前在大田生产中主要以扦插和分根繁殖为主。由于近年来金银花价格走势不断上升，运用范围不断拓宽，药农对金银花的关注度更是增高。植物组织培养是指在无菌环境下，利用植物离体的细胞，组织或器官在人工培养的条件下生成新的植物体的过程。组织培养能在较短的时间内繁殖出大量的植株，有快速、高效的作用。同时，对于金银花等容易携带病毒，易于退化的植物来说，组织培养可以保持其亲本的优良性状，维持良好品质[4]。在组织培养过程中，面临的主要问题之一便是外植体的杂菌感染，如何将外植体进行有效的灭菌，从而得到大批量无菌苗，应用于大田生产，得到量大、价低且品质好的金银花品种是我们一直努力的方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

金银花：采于山东中医药大学药圃，由山东中医药大学李佳教授鉴定品种为“金华三号”。

主要试剂：MS干粉培养基，无水乙醇，氯化汞，纳米银(直径为120 nm)，琼脂粉，蔗糖，氢氧化钠，I-BA。

高压灭菌锅，超声波清洗机，PH检测仪，无菌操作台。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理 取金银花新生幼嫩茎尖2～3 cm长，用清水浸泡清洗10 min后用吸水纸擦干，再用质量分数为1.0%的洗衣粉溶液浸泡20 min后再用清水冲洗30 min，用吸水纸擦干剪掉茎底部变色发黑部分，处理后长约为2 cm茎尖为备用外植体。

1.2.2 样品灭菌方式 我们选择灭菌和抑褐效果较好的乙醇和氯化汞为灭菌剂[5]。

1.2.2.1 碱化乙醇处理 将预处理后的外植体正交实验优选出实验方案，将乙醇浓度，氢氧化钠质量分数，处理时间和温度为影响因素，污染率，褐化率和成活率作为评价标准，采用四因素三水平进行比较。正交实验因素水平表见表1，正交实验结果及分析见表2。使用乙醇浓度分别为70%、75%、80%；氢氧化钠质量分数分别为0.5%、1.0%、1.5%；处理时间分别为20、30、40 s；处理温度分别为20、25、30 ℃。经优化得到L9(34)的正交试验。

表1 正交实验因素水平表

1.2.2.2 氯化汞处理 使用质量分数为0.1%的氯化汞溶液，处理时间分别为5、6、7、8 min。

1.2.2.3 混合处理 A处理：乙醇浓度75%，氢氧化钠质量分数为1.0%的碱化乙醇处理30 s+质量分数0.1%氯化汞7 min。

B处理：直接将备用外植体用无菌水冲洗3遍并用无菌吸水纸擦干后接种到1/2 MS+0.7%琼脂+3.0%蔗糖+0.1%纳米银+3.0 mg·L-1IBA的培养基上。

C处理：将备用外植体用无菌水冲洗3遍并用无菌吸水纸吸净水分后接种于1/2 MS+0.7%琼脂+3.0%蔗糖+3.0 mg·L-1IBA银的培养基上。

每个处理接种20瓶，重复三次。

1.2.3 培养基类型 a型：1/2 MS+0.7%琼脂+3.0%蔗糖+3.0 mg·L-1IBA[6]

b型：1/2 MS+0.7%琼脂+3.0%蔗糖+0.1%纳米银+3.0 mg·L-1IBA

培养基pH在5.8～6.0之间。

1.2.4 培养环境 将接种后的外植体置于无菌组织培养室中，温度25 ℃左右，湿度60%，光照2000 lx，光照时间16 h·d-1。

培养15 d内看污染情况，30 d内看死亡及褐化情况并及时做好记录。

(1)

(2)

(3)

2 结果与分析

2.1 不同灭菌处理后灭菌效果

2.1.1 碱化乙醇处理效果 由于金银花外被疏绒毛和疏腺毛，灭菌较为困难。在灭菌剂中加入适量的氢氧化钠，可增大灭菌剂与金银花表面的接触面积，提高灭菌率。

在实验中我们发现，乙醇浓度低，灭菌时间短都可能造成灭菌不彻底，污染率就相应增高，乙醇浓度过高，灭菌时间增长则使外植体褐化率增高，成活率降低，而氢氧化钠的浓度过高则过分破坏了金银花表面，使其褐化率增高。根据表2可知，处理时间的极差值最高为1.314，为四个因素中最重要因素。本实验中最适处理时间为30 s。实验五中氢氧化钠的质量分数为1.0%，处理时间为30 s，乙醇的浓度为75.0%，温度为25 ℃时外植体污染率和褐化率较低，成活率最高，为最优灭菌方法。

实验结果=污染率×0.3+褐化率×0.3+成活率×0.4

(4)

表2 碱化乙醇对顶芽灭菌正交实验安排及结果

通过表3我们可以看出，处理时间对金银花外植体灭菌处理结果的影响达到极显著水平，乙醇浓度和氢氧化钠质量分数对金银花外植体灭菌处理结果的影响达到显著水平，温度对金银花外植体灭菌处理结果的影响不显著。

表3 正交设计方差分析表

注：*表示P<0.05。

2.1.2 验证实验 最佳方案(实验5)进行三批实验验证，得出实验结果如表4所示，三次结果同实验五结果比较变动较小，说明结果稳定。

表4 最佳方案验证实验

2.1.3 氯化汞处理效果 氯化汞是灭菌效果较强的灭菌剂，灭菌时所需浓度较低。通过表5我们不难发现，用0.1%的氯化汞处理7 min时，外植体的污染率和褐化率处在一个相对较低的水平，成活率达到88.3%，这一试验也验证了文明玲等的研究结果[7]。且通过表2和表5对比，我们发现，0.1%的氯化汞灭菌效果远远高于乙醇，且对外植体的破坏较小，成活率更高。

表5 氯化汞对顶芽灭菌效果

2.1.4 混合处理灭菌效果 通过表6我们发现，A处理是将碱化乙醇和氯化汞相结合进行处理，得到的外植体灭菌效果确实有所增加，但褐化率也有一定程度的上升，我们认为，可能是较长时间的试剂处理使外植体外表损坏增大，从而使褐化率增加，成活率有一定的下降。在表六这几个处理中，不难发现，B处理是效果最好的处理方式，污染率低至1.7%，褐化率为3.3%，成活率高达96.7%。在B处理过程中，我们最小化的降低对外植体的破坏，只将其外带的细菌病毒等杀灭，然后接种于含有纳米银的培养基上，就达到了较好的效果。将B处理与C处理对照，两者之间差别为是否含纳米银分子，显而易见，纳米银在抑制杂菌生长方面有着较为显著地效果。纳米银是直接通过损伤细菌的细胞壁、细胞膜甚至对细菌的代谢产生影响来达到抑菌的作用。且纳米银具有无耐药性，无毒无害，广泛应用于临床试验中[8-9]。从C处理中我们也可以发现，破坏较小的外植体褐化率较低，且其污染率及成活率也是有一定的参考之处。因此笔者认为，金银花外植体含有的成分绿原酸等具有抑菌抗病毒的作用，从而使得金银花外植体自身产生抵抗外界杂菌病毒的机制，使其污染率到达一个与表2中1号处理几乎持平的效果。

采用不同浓度，不同质量分数、不同处理时间的碱化乙醇灭菌实验，找到最优方案再与氯化汞处理相结合达到最优的灭菌结果。

表6 混合处理对顶芽的灭菌效果

3 结论与展望

金银花外植体灭菌方式多种多样，外被疏绒毛、疏腺毛等特征，使得灭菌方法与其他植物相比有所不同。试剂处理后最佳灭菌方式为浓度75.0%乙醇与质量分数1.0%氢氧化钠混合形成碱化乙醇处理30 s加质量分数0.1%氯化汞处理7 min得到污染率5.0%，成活率88.3%的处理方式。考虑到大田生产的成本问题，0.1%的氯化汞处理7 min则更为合适。同时，本实验中最优灭菌方法为在含有纳米银的b型培养基上接种经无菌水冲洗干净的外植体，可以达到98.7%的灭菌率，96.7%的成活率。

随着科技的发展，试验水平和仪器设备标准的提升，无菌处理以及组织培养技术将会达到一个更高的水平。