平卧菊三七提取物抗氧化活性研究与抗氧化特征成分的HPLC-MS/MS分析△

赵玉荣，陆姗姗，朱张新，张培瑞，刘晨，刘俊，何立巍

南京中医药大学翰林学院 药学院，江苏 泰州 225300

平卧菊三七GynuraprocumbensLour.为菊三七属多年生草本植物，药食兼用，多分布于东南亚地区，如马来西亚、泰国；在我国主要分布于广东、云南等地。平卧菊三七具有降糖、抗肿瘤、抗氧化等功效[1-3]。研究表明，平卧菊三七中含有多种显著抗氧化作用的天然成分，如有机酸类、黄酮类以及三萜类成分[4-5]。但目前研究还未明确平卧菊三七中的具体抗氧化成分。由于平卧菊三七中含有的成分复杂，DPPH活性检测及HPLC-MS/MS技术正越来越多被应用于其活性成分的发现与确证[6-7]。本实验采用乙醇回流法提取平卧菊三七中活性成分，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取其中的活性成分得到各部位成分，并结合体外DPPH自由基清除实验筛选各部位的抗氧化活性大小。采用HPLC-MS/MS对抗氧化活性较高的部位进行成分的分析，以便进一步研究平卧菊三七的药效物质基础。

1 材料

1.1 仪器

安捷伦1200系列高效液相色谱仪、6520系列电喷雾-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS/MS)；真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司，恒DZF系列)；分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，RE-52A)；超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司，KH-500B型)。

1.2 试药

绿原酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y24J7K16726)；阿魏酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：H27J7L16718)；芦丁对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y01D8S49613)；杨梅素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：YM0311YA13)；槲皮素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：20J6Y1722)；咖啡酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，质量分数99%)；DPPH(Sigma公司)；甲醇为色谱纯；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 平卧菊三七提取物的制备

平卧菊三七药材购于江苏省野生蔬菜研究所，由南京中医药大学翰林学院中药鉴定教研室刘晨老师鉴定。取干燥地上部分药材粉碎，称取25 g，每次加入10倍量80%乙醇，80 ℃下回流提取1 h，共提取3次，合并提取液并浓缩至终体积为30 mL，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取3次，合并萃取液，浓缩，得各部位样品。

2.2 平卧菊三七各部位清除DPPH自由基能力的测定

对何英杰等[6]的方法进行改良，分别将50 μL质量浓度分别为0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1的平卧菊三七各部位提取物溶液加入96孔板中，然后再加入150 μL质量浓度为0.11 mg·mL-1的DPPH溶液，充分震荡混合均匀，在室温避光下静置10 min。之后，在波长517 nm处测定每孔的吸光度值，记为样品吸光值A1。阴性对照组中加入50 μL乙醇，测定值为A0，阳性对照药是维生素C(Vc)，每个试样做4次平行实验，取其平均值。自由基的清除率以如下公式计算。

DPPH自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%

(1)

2.3 液相色谱条件

精密称取平卧菊三七乙酸乙酯部位提取物100 mg，加入甲醇20 mL，超声提取30 min，配制成质量浓度为5 mg·mL-1的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，由自动进样器进样，进样量5 μL；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；采用汉邦Kromasil-C18反相色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)，洗脱条件：采用梯度洗脱，0～5 min，10%B；5～25 min，30%B；25～70 min，55%B。化合物用二极管阵列检测器在254 nm的波长下检测。

2.4 串联质谱条件

ESI离子源，离子源喷雾电压： 3.0 kV，雾化器压力： 0.2 MPa，干燥氮气(N2)流速：9 L·min-1，干燥氮气(N2)温度：350 ℃，扫描范围为m/z：100～1000，负离子模式扫描。

2.5 数据处理

采用Graphpad Prism 7软件计算药物对DPPH自由基清除率的IC50值。

3 结果

3.1 平卧菊三七提取物不同极性部位得率及清除DPPH自由基能力的测定

采用2.1的提取方案，得到石油醚部位0.531 8 g，得率2.1%；乙酸乙酯部位0.084 7 g，得率0.33%；正丁醇部位0.376 5 g，得率1.49%；水部位2.533 0 g，得率10%。按照2.2的方法分别测定平卧菊三七石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物、乙醇提取物在质量浓度0.156～5 mg·mL-1和Vc对DPPH自由基的清除活性，结果表明，在最低质量浓度0.156 25 mg·mL-1下，乙酸乙酯和正丁醇对DPPH的抑制率达到89.17%和62.86%，显示出较强的清除DPPH自由基活性，不同极性部位清除DPPH自由基的顺序为：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>乙醇提取物>石油醚部位>水部位。笔者分别测定了乙酸乙酯部位和正丁醇部位在质量浓度为3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500 μg·mL-1和Vc对DPPH自由基的清除活性，结果见图1。Vc、乙酸乙酯部位和正丁醇部位的IC50分别是12.19、28.8、321 μg·mL-1，表明乙酸乙酯部位对DPPH自由基清除能力最强，提示乙酸乙酯部位中含有的化学成分可能是平卧菊三七抗氧化的活性成分。因此，我们采用HPLC-MS/MS技术对乙酸乙酯部位的化学成分进行分析。

图1 平卧菊三七地上部分提取物乙酸乙酯部位和正丁醇部位对DPPH自由基的清除率

3.2 平卧菊三七乙酸乙酯部位化学成分鉴定

通过液质联用(LC-MS)技术按上述条件对平卧菊三七乙酸乙酯部位成分进行分析，得到254 nm下的液相色谱图(图2A)及ESI负离子模式下总离子流图(图2B)。通过液质联用电喷雾四级杆飞行时间质谱仪(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)检测得到平卧菊三七提取物乙酸乙酯部位各化学成分的保留时间及质谱裂解信息，通过总离子流图、对照品总离子流图及相关文献数据对比分析，对平卧菊三七提取物乙酸乙酯部位的化学成分进行确认，鉴定得到11个化合物，见表1。

注：A.HPLC-PDA图；B.HPLC-Q-TOF-MS总离子流图。图2 平平卧菊三七地上部分液质联用色谱图

3.3 根据质谱裂解特征鉴定平卧菊三七提取物乙酸乙酯部位的化学成分

色谱峰1的准分子离子峰为[M-H]-m/z153裂解产生了109、91、81、65、53，符合原儿茶酸的裂解规律，并和文献报道一致[8]，鉴定化合物1为原儿茶酸。

色谱峰3的准分子离子峰为[M-H]-m/z353裂解产生了191、69等碎片离子峰，和绿原酸对照品裂解规律一致，鉴定化合物3为绿原酸。通过文献发现[9-10]，植物中多同时存在绿原酸的异构体，其中包含绿原酸、新绿原酸及隐绿原酸，通过对总离子流图提取353母离子发现，在洗脱时间10～25 min，出现3个绿原酸异构体，结合文献研究，绿原酸异构体在C18柱的洗脱顺序为新绿原酸、绿原酸及隐绿原酸。因此，根据色谱峰的洗脱时间，鉴定化合物2、3、4分别为新绿原酸、绿原酸及隐绿原酸，其裂解规律亦符合文献报道。色谱峰5的准分子离子峰[M-H]-m/z179裂解产生了135、117、107等碎片离子峰，经与咖啡酸对照品比较，裂解规律一致，故鉴定其为咖啡酸。色谱峰6的准分子离子峰为[M-H]-m/z337裂解产生了191、93、163等碎片离子峰，符合5-O-香豆酰奎宁酸的裂解规律，并和文献报道一致[9]，鉴定化合物6为5-O-香豆酰奎宁酸。色谱峰7的准分子离子峰为[M-H]-m/z163裂解产生了191、93、65等碎片离子峰，符合对香豆酸的裂解规律，并和文献报道一致[8]，鉴定化合物7为对香豆酸。色谱峰8、9、11的准分子离子峰都为[M-H]-m/z515，通过其裂解特征及文献对照[9]，鉴定为异绿原酸的异构体，其在C18柱洗脱顺序为异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C。进一步通过对总离子流图提取515母离子发现，在洗脱时间38～48 min，出现3个异绿原酸的异构体，结合文献研究及各峰的裂解规律，鉴定化合物8、9、11分别为异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C。色谱峰10的准分子离子峰为[M-H]-m/z609裂解产生了301、463等碎片离子峰，和芦丁的对照品裂解规律一致，鉴定为化合物10为芦丁。

4 讨论与结论

本实验采用乙醇回流法提取平卧菊三七中的活性成分，进一步以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到不同极性部位，采用体外DPPH自由基清除活性实验筛选出活性部位为乙酸乙酯部位。因而，本实验室进一步利用HPLC-MS/MS对清除DPPH自由基活性较好的乙酸乙酯部位进行了成分分析，其中鉴定出11个化合物，主要是有机酸类成分，包括绿原酸异构体和异绿原酸异构体，这些成分具有显著的抗氧化活性，可以判定，绿原酸异构体及异绿原酸异构体等有机酸类物质可能是平卧菊三七提取物抗氧化活性的物质基础之一，但其中也有正丁醇部位含有的一些黄酮类成分也具有抗氧化活性，还需要进一步研究。