响应曲面法优化马齿苋中总生物碱的提取工艺△

梁艳妮，李若岚，唐志书，千磊，张东博，刘世军，宋忠兴，王征

陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心/陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083

马齿苋为马齿苋科植物马齿苋PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分，为草本药食同源植物，全国均有分布，具有清热解毒、凉血止血、止痢作用[1]。临床常用于热毒血痢、痈肿疔疮、丹毒、蛇虫咬伤、湿疹、便血、痔血、崩漏下血等[2-3]。国内外学者对其化学成分、药理作用进行研究，马齿苋主要含有生物碱类、萜类、香豆素类、黄酮类、有机酸类、挥发油及多糖等化学成分，具有抗炎、镇痛、抑菌、降血脂血糖、抗肿瘤等药理作用[4-6]。马齿苋生物碱能有效抑制乳腺癌细胞的增长，调控肿瘤细胞代谢[7]。优化马齿苋生物碱的提取工艺对于进一步的药理作用研究具有重要意义。

目前在生物碱提取工艺中使用较多的方法为超声波法和加热回流法[8-10]。大部分生物碱难溶或不溶于水，与酸结合后易溶于水和醇，可采用醇类溶剂提取后配合酸水溶解，碱化游离后有机溶剂萃取得到总生物碱。Box-Behnken效应面法将各个因素与响应值之间的函数关系用多项式进行拟合，精确表述因素与响应值的关系[11]。本实验拟通过单因素试验与响应面分析法优化马齿苋总生物碱的乙醇回流粗提取工艺，为其马齿苋生物碱的分离纯化提供参考。

1 材料

UV-2600型紫外分光光度计(日本岛津公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；GB204型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；FA2004B型万分之一电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；VaCo5低温冷冻干燥仪(Zibrus Technology)；HH-2型恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；FE-1000AD固体粉碎机(天津鑫博得仪器有限公司)。

咖啡因对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq16052505，纯度：HPLC≥98%)；所用试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

马齿苋(批号：20171101，陕西兴盛德药业有限责任公司)为马齿苋科植物马齿苋PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分，由陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定。

2 方法与结果

2.1 总生物碱的测定

2.1.1 对照品溶液的配制 参照扈本荃等[12]马齿苋总生物碱的含量测定，准确称取咖啡因对照品10 mg，放置于25 mL容量瓶中，加入少量无水乙醇使其溶解后定容，摇匀，备用。

2.1.2 溴甲酚绿缓冲溶液的配制 准确称取溴甲酚绿0.125 mg，加入250 mL烧杯中，用5%的NaOH溶液12.5 mL使其溶解，再准确称取邻苯二甲酸氢钾2.5 g，加入适量蒸馏水使其溶解后转移至250 mL容量瓶中，定容后调节pH至4.4，备用。

2.1.3 标准曲线的绘制 准确量取0、1、2、3、4、5、6 mL 2.1.1项下对照品溶液，分别置于10 mL容量瓶中，分别加入1 mL溴甲酚绿缓冲溶液和2 mL无水乙醇溶液，用蒸馏水定容至刻度线后摇匀放置15 min。以629 nm为测定波长，测定对照品溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。所得回归方程为Y=2.607X+0.015 2，r=0.999 5。结果表明，在质量浓度范围40～240 mg·mL-1线性良好。

2.1.4 供试品溶液的配制 将干燥马齿苋药材粉碎，精确称取马齿苋粗粉30 g，在考察提取因素条件下(回流时间、回流温度和料液比)加入95%乙醇于500 mL圆底烧瓶加热回流提取，保持微沸，共提取2次，抽滤，将滤液合并，回收乙醇后将所得浸膏于烧杯中蒸馏水超声溶解。用盐酸调节提取液pH=3～4，搅拌均匀后，转移至500 mL分液漏斗中，使用乙酸乙酯以体积比为1∶1萃取3次，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯。再将水相用氨水调节pH=10～11，搅拌均匀后，二氯甲烷以体积比1∶1萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，回收二氯甲烷后得马齿苋总生物碱，精密称质量。

将提取得到的马齿苋总生物碱溶于10 mL无水乙醇，定容于25 mL容量瓶中摇匀，备用。按照2.1.3项下方法测定吸光度，根据咖啡因标准曲线计算总生物碱的提取率。

2.2 单因素试验

2.2.1 回流时间对马齿苋总生物碱提取率的影响 精确称取干燥马齿苋粉末30 g于500 mL圆底烧瓶中，以95%乙醇为提取试剂，固定回流提取温度为75 ℃，料液比为1∶7，分别考察回流时间为1、1.5、2、2.5、3 h时马齿苋中总生物碱的提取率，见图1。

图1 回流时间对总生物碱提取率的影响

从图1可以看出马齿苋中生物碱的提取率随回流时间的增加先增后减，当回流时间在1～2.5 h时提取率呈现上升趋势，在2.5 h时达到最大提取率，为0.223%；当回流时间在2.5～3 h时提取率呈现下降趋势。综上所述，可确定当回流时间为2.5 h，此时生物碱的得率最高。

2.2.2 回流温度对马齿苋总生物碱提取率的影响 精确称取干燥马齿苋粉末30 g于500 mL圆底烧瓶中，以95%乙醇为提取试剂，固定回流提取时间为2 h，料液比为1∶7，分别考察回流温度为70、75、80、85、90 ℃时马齿苋中总生物碱的提取率，见图2。

图2 回流温度对生物碱提取率的影响

从图2可知，当回流温度在70～80 ℃时，马齿苋中生物碱的提取率呈现上升趋势，在80 ℃时可达到最大提取率为0.199%；当回流温度在80～90 ℃时提取率呈现下降趋势。综上所述，可确定回流温度为80 ℃，此时生物碱的得率最高。

2.2.3 料液比对马齿苋总生物碱提取率的影响 精确称取干燥马齿苋粉末30 g于500 mL圆底烧瓶中，以95%乙醇为提取试剂，固定回流提取时间为2 h，提取温度为75 ℃，分别考察料液比为1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10时马齿苋中总生物碱的提取率，见图3。

图3 料液比对生物碱提取率的影响

从图3可知，当料液比在1∶6～1∶8时生物碱提取率呈现上升趋势，1∶8时最大提取率为0.204%；当料液比在1∶8～1∶10时生物碱提取率呈现下降趋势。综上所述，可确定料液比为1∶8，此时生物碱的得率最高。

2.3 Box-Behnken响应面试验设计

2.3.1 响应模型建立与分析 根据单因素试验筛选的提取时间、提取温度和料液比，采用Design-Expert.V8.0.6软件中Box-Behnken模型设计试验组，以回流时间(A)、回流温度(B)、料液比(C)3个因素为自变量，将马齿苋总生物碱提取率作为响应值，进行响应面分析。Box-Behnken试验设计因素水平表见表1，试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平表

表2 Box-Behnken试验设计与结果

表3 响应面回归模型方差分析

注：**P<0.01，差异有统计学意义；*P<0.05，差异有统计学意义。

2.3.2 响应面图分析与优化 通过多元回归方程作三维效应曲面图和二维平面等高线图，从图4～6可以直观分析三个因素之间的交互作用以及对总生物碱提取率的影响。

图4 提取时间与提取温度对马齿苋生物碱提取率的响应面图和等高线图

图5 提取时间与料液比对对马齿苋生物碱提取率的响应面图和等高线图

图6 提取温度与料液比对马齿苋生物碱提取率的响应面图和等高线图

由图4提取时间与提取温度交互作用显示，提取时间变化曲面比提取温度变化曲面陡峭；等高线图呈椭圆形表明二者交互作用显著。由图5提取时间与料液比交互作用显示，料液比变化曲面比提取时间曲面稍陡峭；等高线图呈椭圆形表明二者交互作用显著。由图6料液比与提取温度交互作用显示，料液比变化曲面比提取温度变化曲面陡峭，二者交互作用不显著。

2.3.3 验证实验 根据响应面分析结果确定回流提取马齿苋总生物碱的最佳工艺参数为提取时间2 h，提取温度66.75 ℃，料液比1∶9，在该条件下马齿苋中总生物碱的提取率可达到0.207%。实际操作调整为提取时间2 h，提取温度66 ℃，料液比1∶9，验证实验得马齿苋中总生物碱提取率为0.199%，与模型预测提取率十分接近，说明用响应面法优选的提取条件可靠。

2.4 DPPH·清除活性

将提取的马齿苋生物碱配成质量浓度为1 mg·mL-1的甲醇溶液。移取上述生物碱甲醇溶液2 mL置于100 mL的容量瓶中，甲醇定容，进一步分别稀释为0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1的样品溶液。

按照陈智坤等[13]清除DPPH·的方法，向6支试管中分别加入2 mL 0.048 mg·mL-1的DPPH·甲醇溶液和2 mL系列浓度的马齿苋生物碱甲醇溶液，充分混合，室温避光反应30 min后测定在517 nm处的吸光度A实验；以等体积的甲醇代替马齿苋生物碱溶液，同法操作，测定吸光度为A空白。每组平行测量3次，取其平均值。DPPH·清除能力计算公式为：

清除率(%)=(A空白-A实验)/A空白×100%

(1)

图7 不同质量浓度马齿苋总生物碱对DPPH·的清除作用

从图7可看出马齿苋生物碱对DPPH·的清除率随着浓度增大而增强，在0.01～0.20 mg·mL-1呈一定量效关系，当马齿苋总生物碱质量浓度为0.20 mg·mL-1时清除率达84.40%。

3 讨论

在提取工艺参数的优化中，影响因素和响应值之间往往具有高度非线性关系，响应面法通过设计有限次数试验，建立包括各显著因素一次项、平方项和交互项的多元二次模型，拟合因素与响应值间的全局函数关系。通过对影响响应值的各因素水平及其交互作用进行优化和评价，快速有效地确定多因素影响的最佳条件，精度高，预测性好。本研究在单因素试验基础上，采用Box-Behnken效应面法设计试验并进行马齿苋总生物碱的回流提取工艺优化，建立的二次多项回归模型极显著，失拟项不显著，拟合度好，能够准确地反映萃取前95%乙醇回流提取时料液比、提取时间和提取温度对马齿苋总生物碱提取率的影响。利用此模型得到的马齿苋总生物碱乙醇回流提取最佳条件为料液比1∶9，提取时间2 h，提取温度66 ℃，生物碱提取率为0.207%。由验证实验可知，Box-Behnken效应面法得到的理论优化结果与实验值接近，说明所采用的响应面法优化结果可靠。采用非线性拟合模型接近客观事实，效应面三维图使因素对指标的影响更为直观、方便，实验精度高。马齿苋生物碱对DPPH·的清除能力具有浓度依赖性，总生物碱浓度在0.2 mg·mL-1时清除率可达84.40%。有关马齿苋生物碱的抗氧化活性还需进一步考察。