基于HPLC指纹图谱的当归不同干燥品质量研究△

李旭，李成义*，陈杰，焦彦斌，强正泽，李波，王明伟

1.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃天士力中天药业有限责任公司，甘肃 定西 748100

当归来源于伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，始载于《神农本草经》。味甘、辛，性温。具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效[1]。当归所含化学成分复杂多样，主要涉及挥发油、有机酸、多糖和黄酮等成分[2-6]。现行的当归质量标准由辨别真伪优劣的定性指标(如采收期、产地、性状等)和定量指标(如水分、挥发油、阿魏酸含量等)组成，控制的是当归某部分组分，忽略了多组分的协同作用。中药指纹图谱基于对中药物质群整体作用的认识，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点，与中医整体观相适应，成为中药的“化学条码”，是实现鉴别中药真伪优劣的可行模式[7-9]。

中药材产地加工是中药材生产和品质形成必不可少的重要环节，这一环节的实现使药材质量得以保证，且便于贮存、运输[10-11]。传统干燥加工方法简单易行，但往往干燥周期长、费时费力，无标准可循，导致加工中药材品质参差不齐。现代干燥加工方法的涌现，为中药材干燥加工增添了新的内容。本实验采用HPLC指纹图谱技术，建立了当归HPLC指纹图谱，通过相似度评价、主成分分析和聚类分析对当归不同干燥品进行了分析，以期为评价当归干燥方法提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，FW177型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，CAV214C型电子天平(美国奥豪斯公司)，BT25S型1/100 000电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，Milli-Q Century超纯水机(德国默克公司)。

1.2 材料

对照品阿魏酸、绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-201718，110753-201718)；洋川芎内酯A、正丁基苯酞、Z-藁本内酯(北京北纳创联生物技术研究院，批号分别为62006-39-7，6066-49-5，4431-01-0)；乙腈为色谱纯；其余为分析纯。

当归新鲜样品采自当归主产区甘肃岷县，经甘肃中医药大学药学院李成义教授鉴定为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的根。将采集的新鲜当归根做不同的干燥处理，样品信息见表1。

表1 当归样品信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件[12]

色谱柱为TC-C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～25 min，5%～25%A；25～40 min，25%～55% A；40～60 min，55%～80% A)，流速0.6 mL·min-1，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取阿魏酸、绿原酸、洋川芎内酯A、正丁基苯酞对照品适量，精密称定，加甲醇溶解于10 mL容量瓶中，配制成质量浓度为0.21、0.25、0.14、0.06 mg·mL-1的阿魏酸、绿原酸、洋川芎内酯A、正丁基苯酞混合对照品溶液；精密称定Z-藁本内酯对照品15.23 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至5 mL，即为Z-藁本内酯对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取当归药材粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20 mL 50%甲醇水，密塞，称定重量。超声提取40 min后冷却，再以50%甲醇水补足减失的重量，摇匀，静置。取上清液过0.45 μm微孔滤膜，即为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取S11号样品约1.0 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，检测指纹图谱。各共有峰的相对峰面积RSD均小于2.56%，相对保留时间RSD均小于0.3%。将连续进样6次得到的色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.1版)进行相似度分析，结果显示相似度均大于0.990，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取S11号样品约1.0 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备1份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h进样检测，测得各共有峰的相对峰面积RSD均小于2.93%，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.25%。将样品图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.1版)进行相似度分析，结果显示相似度均大于0.990，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 分别取S11号样品6份，每份约1.0 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，分别进样检测。测得各共有峰的相对峰面积RSD均小于2.67%，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.2%。将得到的图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.1版)进行相似度分析，结果显示相似度均大于0.990，表明方法重复性良好。

2.5 当归药材指纹图谱研究

2.5.1 指纹图谱的建立 取42批当归药材按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，得到当归不同干燥品的液相色谱图。取绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、Z-藁本内酯对照品按“2.2”项下制备对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，得到绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯A、正丁基苯酞的混合对照品的液相色谱图和Z-藁本内酯对照品的液相色谱图，见图1。将42批当归药材的液相色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.1版)，设S41为参照图谱，采用中位数、时间窗为0.1的方法，经多点校正后对色谱峰进行全谱图匹配，见图2，并生成共有模式的对照指纹图谱，见图3。

2.5.2 共有峰的标定 根据所建立的当归指纹图谱，在对照指纹图谱上共标定出24个共有峰，见图3。通过与对照品溶液色谱图的比对，指认了其中的4个共有峰，分别为7号峰绿原酸、11号峰阿魏酸、22号峰洋川芎内酯A、24号峰Z-藁本内酯。经比对，22号峰后紧接着出的峰(52.4 min)为正丁基苯酞，在某些样品中未检测到该峰。其中11号峰阿魏酸分离度高，是2015年版《中华人民共和国药典》规定的当归指标性成分且峰面积较大，故以其作为参照峰计算其余各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果发现不同干燥处理的样品相对保留时间RSD均<3%，而相对峰面积的RSD偏大，说明当归不同干燥品的共有成分相对含量差异较明显。

2.5.3 相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.1版)对 42 批样品的指纹图谱数据进行分析，计算 42批当归和对照指纹图谱之间的相似度，结果见表2，相似度均大于0.920，表明当归不同干燥品间相似度较好。

2.5.4 当归不同干燥品HPLC指纹图谱比较 根据计算得到的共有峰相对保留时间和相对峰面积分析，当归不同干燥品差异主要集中在峰面积上，即化学成分的种类差别不大，但各共有峰对应化学成分的含量均有明显差异。值得注意的是，S40～S42(阴干样品)中正丁基苯酞峰(出峰时间52.4 min)未检测到，可能是因为阴干过程耗时长，该成分损耗较大；S37～S39(熏干样品)在13.2 min处比其他样品多出了1个峰，且峰面积较大，可能为传统熏干当归的特征峰。

注：1.绿原酸；2.阿魏酸；3.洋川芎内酯A；4.正丁基苯酞；5.Z-藁本内酯。图1 混合对照品HPLC图(A)和Z-藁本内酯对照品HPLC图

图2 42批当归药材叠加指纹图谱

图3 对照指纹图谱

表2 不同干燥品指纹图谱相似度评价

2.6 主成分分析

将共有峰峰面积导入SPSS 21.0软件，对24个共有峰进行主成分分析，得到24个共有峰的初始特征值和方差贡献率(表3)。前5个成分的方差累积贡献率达86.093%，特征根大于1，可以代表当归指纹图谱中24个共有峰的大部分信息。由因子载荷矩阵得到主成分载荷矩阵U，以特征向量U值作为系数，得到5个主成分的表达式，将原始变量标准化处理后计算得到Y1、Y2、Y3、Y4、Y5的值。以各公因子的旋转之前的方差贡献率为权重系数，计算当归不同干燥品的综合得分，Y=0.418Y1+0.186Y2+0.128Y3+0.077Y4+0.052Y5。由表4可知，排名靠前的样品有60 ℃微波干燥、减压干燥、60 ℃热泵干燥品。

表3 主成分特征值及方差贡献率

表4 当归不同干燥品综合得分及排名

2.7 聚类分析

以主成分得分作为变量，运用组间联接法进行系统聚类分析，结果见图4。当欧氏距离为25时，14批样品可分为两大类，S37、S38、S39聚为一类，其余样品聚为另一类，即熏干样品单独聚为一类，其余干燥方法得到的样品聚为一类。欧氏距离为18时，剩余干燥品聚为两类，阴干和晒干品聚为一类，其余聚为另一类。

图4 当归指纹图谱聚类分析

3 讨论

为保证建立的当归不同干燥品HPLC指纹图谱出峰数目多、分离度好，本实验前期对色谱条件进行了考察。考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-1%乙酸水三种流动相，发现以乙腈-1%乙酸水溶液为流动相分离效果最佳，出峰数目多，故选择乙腈-1%乙酸水溶液为流动相；考察了235、254、275、280、320 nm五个检测波长，发现在280 nm下，图谱基线平稳，色谱信息较为全面，故选择280 nm作为检测波长；考察了1.0 mL·min-1和0.6 mL·min-1两个流速对色谱图的影响，发现0.6 mL·min-1流速下分离效果更佳，故选择0.6 mL·min-1作为最佳流速。

本实验运用相似度评价、主成分分析和聚类分析方法对当归不同干燥品HPLC指纹图谱进行分析。相似度分析结果显示，各样品间相似度均大于0.920，表明当归不同干燥品间相似度良好。主成分分析结果显示60 ℃微波干燥、减压干燥、60 ℃热泵干燥样品排名靠前，而评分较低的的几批当归为晒干、阴干、熏干品。当归为油质类药材，减压干燥能最大程度的减少干燥过程中化学成分的损失，传统阴干、晒干、熏干品干燥时间长，干燥效率低，在长期干燥的过程中，伴随失水其化学成分的含量明显降低。本实验结果排名靠前的样品有60 ℃干燥品，跟相关文献报道[13-14]有出入，基于此研究结果，可能的原因是高温干燥下鲜药材快速失水，致使药材表面形成“硬皮”，药材内部失水变缓，化学成分损失亦减缓。

2015年版《中华人民共和国药典》描述的当归干燥方法为熏干，历史上鲜有本草记载以熏干为当归干燥方式。聚类分析发现，熏干样品单独聚为一类，其余干燥品聚为一类，说明传统阴干、晒干和现代干燥方法得到的当归药材质量较为一致，可为现代干燥技术在当归药材初加工的应用提供一定科学依据。