新胃乃安片中4种异黄酮成分的含量测定及一测多评法的建立△

梁小银，严萍，詹若挺，陈蔚文

广州中医药大学 中药资源科学与工程研究中心/岭南中药资源教育部重点实验室(广州中医药大学)/国家中成药技术研究中心南药研发实验室，广东 广州 510006

新胃乃安片由黄芪、三七、红参、人工牛黄等组成，是基于药效导向及保持原处方不变的原则，对胃乃安胶囊进行二次开发制成的片剂。该产品具有补气健脾、活血止痛的功能，常用于治疗胃及十二指肠溃疡、慢性胃炎等消化道黏膜损伤性疾病[1-2]。在前期的研究中，本课题组发现其作用机制可能与抗氧化、清除自由基、促进多胺合成有关[1]。此外，本课题组还进行了黄芪、红参、三七以及人工牛黄的薄层色谱鉴别和黄芪甲苷含量测定方法的研究[3]。黄芪作为君药对新胃乃安片的疗效发挥具有重要的作用，异黄酮类成分是黄芪的主要活性成分及质量控制指标成分[4-5]，具有抗氧化，清除自由基的作用[6]。蔡海霞等[7]采用一测多评法同时测定黄芪药材中芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷及毛蕊异黄酮苷的含量，但中药复方制剂中黄芪异黄酮成分的一测多评含量测定方法尚未见报道。本实验以芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷及毛蕊异黄酮苷为研究对象，建立了一测多评含量测定方法，为新胃乃安片以及其他含有黄芪的药品的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪(配置Waters 2998二极管阵列检测器、四元泵自动进样系统、Empower化学工作站)；KQ-700DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水设备(法国，Millipore公司)；BS224S电子天平(德国Sartorius，万分之一)；XR205SM-DR电子天平(瑞士Precisa，十万分之一)。

1.2 试药

毛蕊异黄酮苷对照品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号：111007，含量>98%)；芒柄花苷对照品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号：110930：含量>98%)；毛蕊异黄酮对照品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号：100618，含量>98%)；芒柄花素对照品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号：100525，含量>98%)；乙腈(色谱纯，Merk公司)；水为超纯水；甲醇、甲酸等其余试剂均为分析纯。

新胃乃安片(批号分别为20101002、20110301、20110302)以及黄芪阴性样品，由广州白云山中一药业有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters XBridgeTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；以乙腈-0.1%甲酸为流动相，梯度洗脱：0～32 min，5%～18%乙腈；32～38 min，18%～22%乙腈；38～58min，22%乙腈；58～70 min，22%～34%乙腈；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；PDA检测波长为260 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品适量，分别加甲醇适量制成一定质量浓度的对照品母液，再分别吸取适量，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得质量浓度分别0.04、0.008、0.02、0.006 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取新胃乃安片10片，精密称定，研细，精密称取1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声(功率为280 W，频率为40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补重，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液制备

取相当量的黄芪阴性样品，按2.3项下的方法制备黄芪阴性对照溶液。

2.5 专属性试验

进样上述3种溶液各20 μL，依法测定，结果表明，黄芪阴性对照溶液对试验无干扰，方法专属性良好，见图1。

注：A.混合对照品；B.新胃乃安片样品；C.黄芪阴性对照；1.毛蕊异黄酮苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊异黄酮；4.芒柄花素。图1 对照品、新胃乃安片样品及黄芪阴性对照HPLC图

2.6 线性关系、定量限及检测限考察

分别进样上述混合对照品溶液2、5、10、15、20、30 μL各2针，依法测定。以质量浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归；再取2.2项下的各对照品储备液分别加甲醇逐级稀释，依法测定，计算定量限(信噪比为10∶1)和检测限(信噪比为3∶1)。结果见表1，4种异黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。

2.7 重复性试验

精密称取同一批号(20110301)质量差异项下的新胃乃安片6份，各1.0 g，按2.3项下的方法制备并测定，测得毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的平均含量依次为0.212、0.067、0.111、0.032 mg/片，RSD依次为0.2%、0.7%、0.3%、0.6%，结果表明该方法重复性良好。

2.8 精密度试验

取2.7项下制备的同一份供试品溶液连续进样6次，依法测定，计算6次进样测得的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰面积的RSD依次为0.1%、0.2%、0.2%、0.2%，结果表明仪器精密度良好。

2.9 稳定性试验

取2.7项下制备的同一份供试品溶液，分别于0、5、10、20、30、72 h进样测定，计算测得的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素峰面积的RSD依次为0.1%、0.2%、0.2%、0.4%，结果表明供试品溶液在72 h内基本稳定。

2.10 加样回收率试验

精密称取已知含量的新胃乃安片(批号：20110301)0.5 g，共6份，置具塞锥形瓶中，分别加入相当量的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的对照品，按上述方法平行制备测定，计算回收率。结果毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的平均回收率分别为103.5%、99.8%、99.4%、101.6%，RSD分别为1.5%、0.4%、0.6%、1.2%，结果表明该方法准确度良好。

2.11 一测多评法相对校正因子的计算

以毛蕊异黄酮苷为内参物，结合2.6项下混合对照品溶液系列进样浓度及其所得的峰面积，参照王智民等提出的相对校正因子计算公式[8]，计算出毛蕊异黄酮苷与待测成分芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素间的平均相对校正因子分别为1.200、1.463、2.086，RSD值均≤3.7%。

2.12 耐用性考察

2.12.1 相对校正因子 分别考察了不同品牌的色谱柱、不同高效液相色谱系统、不同流速及不同柱温对相对校正因子的影响，结果在不同条件下各相对校正因子的RSD在1.1%～2.6%，表明毛蕊异黄酮苷与待测成分芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素间的相对校正因子重现性良好，见表2。

2.12.2 待测组分色谱峰的定位 分别记录上述考察的不同仪器不同色谱柱、不同流速及柱温等条件下中各待测成分的保留时间，参照王智民等提出的相对保留时间计算公式[8]，计算出各待测成分与毛蕊异黄酮苷的相对保留时间，结果见表3，在不同条件下各成分间的相对保留时间值变化较小，RSD在2.2%～3.6%，芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素与毛蕊异黄酮苷的相对保留时间分别为1.459、1.753、2.436。

2.12.3 样品测定 取供试品3批，每批平行2份，按上述拟定方法测定，分别采用外标法和一测多评法计算4种异黄酮成分的含量，结果见表4，常规的外标法实测值与一测多评法计算的各成分含量的RSD均≤3.1%，说明2种方法测得结果没有显著性差异，一测多评法用于黄芪的成方制剂新胃乃安片的异黄酮类成分的质量控制是可行的。

表1 4种异黄酮成分的线性关系考察

表2 相对校正因子的影响因素和结果

表3 黄芪异黄酮成分相对保留时间的影响因素和结果

表4 黄芪异黄酮成分的一测多评结果 mg/片

3 讨论

一测多评法是利用中药有效成分之间内在的函数和比例关系，以样品中某一典型组分(对照品廉价易得)为内参物，建立其与其他待测成分间的相对校正因子f，通过f计算出其他待测成分的含量，从而实现测定一个代表性成分同步监测多个指标成分[9-10]。待测组分色谱峰的定位、待测组分浓度、对照品纯度以及色谱系统误差等是影响一测多评法准确性的关键因素[11]，其中色谱系统误差因素包括流动相的组成比例、pH值、柱温、流速及检测波长等的微小改变时和使用不同仪器、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、不同实验室、不同操作人员等[8]。研究中采用相对保留时间值对待测组分色谱峰进行定位，分别从3种不同品牌色谱柱和3种不同高效液相色谱仪、不同操作员、不同实验室以及流速、柱温等因素对相对校正因子和相对保留时间的重现性进行考察，结果RSD均<5%，表明该研究建立的一测多评法系统适用性较好。目前一测多评法在药材及复方制剂中应用广泛，但多以测定单味或多味药材中同类多成分为主，而对复方制剂中多味药材不同类成分的测定仍存在局限性[8，11]。

毛蕊异黄酮苷在黄芪中的含有量较高，药理活性明确[12]，且又是《中国人民共和国药典》中黄芪含量测定的指标成分，其对照品易得，在该实验条件下分离度及峰形较好，因此以其为内参物。

采用PDA检测器3D图谱对检测波长进行筛选，结果发现，在波长为249 nm与260 nm下样品色谱图的峰形和各成分的峰面积均较好，色谱峰数目基本一致。对上述两种波长测得的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量进行比较，结果4种成分含量差异不大，RSD均<5%，因研究中以毛蕊异黄酮苷为内参物，《中华人民共和国药典》黄芪中毛蕊异黄酮苷含量测定的检测波长为260 nm，因此选取260 nm作为检测波长。

4 结论

该研究建立的一测多评法同时测定新胃乃安片中4种异黄酮成分的含量具有良好的重现性和稳定性，其测定结果与常规外标法所测的含量间无显著差异，在对照品缺乏条件下，可作为新胃乃安片中4种异黄酮成分的质量评价方法。