黄芪甲苷通过抑制细胞凋亡减轻氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞损伤的研究

杜澍金，赵艳萌，周晓红，高维娟

(河北中医学院 河北省中医药防治心脑血管病基础研究重点实验室，河北 石家庄 050091)

脑血管疾病发病率高、致死/致残率高，是我国居民致死的首位病因[1-2]，尤其是40岁以上人群每年新发脑卒中约300万例，死亡110万例，其中急性缺血性脑卒中约占80%，造成的经济负担高达400亿元/年[3]。缺血性脑卒中一般预后较差，治疗的关键在于尽早恢复缺血区脑组织的血液再灌注，而恢复血液再灌注的过程有时反而引起更加严重的二次脑损伤，即脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)。在CIRI的发生发展过程中炎症、氧自由基、钙超载、毒性氨基酸、能量代谢等均可通过引起细胞凋亡、坏死导致脑组织病理损伤的发生，最终导致神经功能缺损症状的出现。因此，防治细胞凋亡是抑制CIRI的重要环节。前期研究证实，临床常用于中风治疗的中药黄芪[4]的主要活性成分黄芪甲苷对CIRI有保护作用[5]。本实验以PC12细胞为研究对象，通过建立氧糖剥夺/复氧复糖细胞模型模拟CIRI对神经细胞的损伤过程，研究黄芪甲苷对脑缺血再灌注所致神经元损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

PC12细胞(经NGF 诱导高分化)，由河北医科大学第一医院中心实验室主任许顺江教授惠赠。

1.2 主要试剂

黄芪甲苷(HY-N0099，MCE)；胎牛血清，购自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM basic(1×)、胰蛋白酶、1×PBS缓冲液，均购于美国Gibco公司；Earle's平衡盐溶液(1×EBSS，无钙镁糖)购自北京雷根生物科技有限公司；青链霉素混合液购自BIOND公司； Triton X-100、多聚赖氨酸均购自北京索莱宝科技有限公司；Bcl-2单克隆抗体、Caspase-3多克隆抗体购自Abcam公司；Bax多克隆抗体，HRP标记的山羊抗兔IgG、RIPA裂解液、PVDF膜、β-actin、蛋白maker、ECL发光液等购自塞维尔生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥科技有限公；MTS试剂盒，购自Promega公司。

1.3 主要仪器

3111型CO2培养箱，3131型三气培养箱，Varioskan LUX型多功能微孔板读数仪(Thermo公司，超净工作台SW-CJ-ID型(苏州净化公司)，DMI3000B 型倒置显微镜，5417R型低温离心机，酶联免疫检测仪，匀浆器，JA1203电子天平，Bio-rad电泳仪PowerPacTM HC及半干转膜仪Trans- Blot SD Cell，UVP凝胶成像系统。

1.4 PC12细胞培养

PC12细胞于37 ℃水浴中迅速复苏后接种于含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基中，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中常规培养，经 1～2次传代细胞处于对数生长期且生长状态良好时，建立氧糖剥夺/复氧复糖模型。

1.5 氧糖剥夺/复氧复糖模型的建立及分组

对数期生长细胞，随机分为3组：Control组、Model组和AST-IV组。除Control组外，其他各组均氧糖剥夺2 h后复氧复糖24 h：弃去正常细胞培养液，用复温的1×PBS缓冲液轻柔清洗细胞2遍后，更换为无糖的Earle's平衡盐溶液以模拟细胞缺血状态，然后将细胞置于94%N2+5%CO2+1%O2的37 ℃三气培养箱中模拟缺氧状态，培养(氧糖剥夺)2 h后，将Earle's平衡盐溶液更换为正常细胞培养液，置37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养(复氧复糖)。同时，Control组细胞给予换液处理；AST-IV组于复氧复糖的同时给予含黄芪甲苷(终浓度为100 mmol/L)的培养液，Model组细胞给予正常培养液，培养24 h。倒置显微镜观察各组细胞形态，并收集各组细胞进行相应指标的检测。

1.6 倒置显微镜观察细胞形态

将PC12细胞传代于6孔板中，正常培养24 h后，Control组继续正常培养，Model组和AST-IV组先进行氧糖剥夺2 h 处理。之后Control组细胞换液，Model组更换为正常培养液，AST-IV组更换为含黄芪甲苷(终浓度为100 mmol/L)的培养液，继续培养24 h。随后用倒置显微镜观察细胞形态及生长状态(400×)，每组细胞取5个视野，拍照保存。

1.7 MTS法检测细胞存活率

将对数生长期细胞传代于96孔板中，常规培养24 h使细胞贴壁，按造模方法处理各组细胞后，于96孔板中每孔(100 mL)加入20 mL MTS溶液，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育1 h后，在多功能微孔板读数仪中测定450 nm处OD值，检测细胞存活率。细胞存活率=(实验组OD 值-空白组OD 值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.8 Western blot检测Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达

造模结束后，用1×PBS缓冲液清洗细胞2遍；以一次性细胞刮刮取细胞于1.5 mL离心管中；4 ℃下，10 000 rpm离心5 min，弃去上清后再次离心2 min；再弃去上清，加入适量细胞裂解液，冰上裂解细胞30 min；提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。调整上样量后，按比例加入上样缓冲液，混匀，100 ℃煮沸10 min使蛋白变性。SDS-PAGE电泳分离蛋白，半干电转移法将蛋白转移到PVDF膜上，以5 %脱脂奶粉封闭2 h后，相应一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜液洗膜3次后，相应HRP二抗室温下孵育1 h。TBST洗涤后以ECL化学发光法显色。用UVP软件采图，分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参照。

1.9 统计学处理

2 实验结果

2.1 倒置显微镜观察氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞生长状态

Control组细胞贴壁生长，生长状态良好，细胞折光性较强，呈多角形，突触明显，并交织成网。与Control组相比，Model组细胞贴壁较差，折光性减弱，细胞多呈圆形且聚集成团，突触减少甚至消失，部分细胞脱落、漂浮于培养液中。与Model组相比，AST-IV组细胞损伤减轻，折光性增强，突触增多，趋向于正常生长。见图1。

图1 黄芪甲苷对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞形态学变化

2.2 MTS法检测PC12细胞存活率

与Control组相比，Model组细胞存活率明显下降(P<0.05)；与Model组相比，AST-IV组细胞细胞存活率明显升高(P<0.05)，差异有统计学意义。见表1。

表1 黄芪甲苷对各组PC12细胞存活率的影响

2.3 黄芪甲苷对不同组别PC12 细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3的Western blot检测结果比较

与Control组相比，Model组PC12细胞Bax，Caspase-3的表达增多，Bcl-2表达减少(P<0.05)，差异有统计学意义；与Model组相比，AST-IV组PC12细胞Bax、Caspase-3的表达减少，Bcl-2表达增多(P<0.05)，差异有统计学意义(见表2)。

表2 黄芪甲苷对各组PC12细胞Bax、Bcl-2和Caspase 3相对蛋白含量的影响

3 讨论

PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤分化细胞株，经诱导分化后具有交感神经元特性，常用于神经系统疾病的体外研究。氧糖剥夺/复氧复糖细胞模型是较理想的模拟脑缺血再灌注致神经元损伤的细胞模型[6]。本实验以高分化PC12细胞氧糖剥夺/复氧复糖模型模拟临床脑卒中患者经溶栓或其他血管内治疗恢复血流灌注后的临床病理过程中的神经元损伤情况，即脑缺血再灌注所致的神经元损伤，研究黄芪甲苷对CIRI的保护作用及机制。实验结果提示，再灌注的同时给予黄芪甲苷处理可以减轻氧糖剥夺/复氧复糖对PC12细胞的损伤，其保护作用体现在：改善细胞生长状态和形态，提高损伤后细胞存活率，通过促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，降低抗凋亡蛋白Bax表达，抑制细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶Caspase-3蛋白表达，抑制PC12细胞凋亡。

Bcl-2具有抑制凋亡的作用，而Bax可促进凋亡，两者是在功能上相互对立的蛋白，其比值大小决定着损伤细胞是否趋于凋亡[7]。在生理状态下，Bcl-2与Bax形成异源二聚体，稳定线粒体膜的完整性，抑制Caspase-3的活化所介导的凋亡过程[8]；在病理状态下，如细胞受到缺血、缺氧等有害刺激时Bcl-2表达降低，Bax表达增多，且向线粒体膜聚集，形成同源二聚体，导致线粒体通透性增高，致使线粒体内凋亡因子如细胞色素C(Cyt C)和凋亡诱导因子(AIF)释放入胞质，进而启动Caspase级联反应及其他凋亡通路。因此Bax/Bcl-2增高，可促进细胞趋于凋亡，反之则抑制细胞凋亡，且其促进凋亡的机制与增大线粒体膜通透性，导致促凋亡物质的释放有关。有研究发现，脑缺血引起的迟发性神经元死亡即是神经元的凋亡，且神经元的凋亡与缺血缺氧引起的起脑组织Bcl-2蛋白的一过性表达增加及Bax蛋白的持续表达增多有关[9]。而本研究发现黄芪甲苷可促进氧糖剥夺/复氧复糖后PC12细胞Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达的增多，导致Bax/Bcl-2减小，这可能是黄芪甲苷抑制CIRI所致神经元凋亡的重要因素之一。本实验发现经氧糖剥夺/复氧复糖处理后，PC12细胞Bcl-2水平降低、Bax水平升高，表明细胞凋亡增多，而在复氧复糖的同时给予黄芪甲苷处理后，Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明黄芪甲苷增强了细胞对抗凋亡的能力。

Caspase-3在细胞凋亡过程中起着不可替代的作用，是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。有研究证实黄芪甲苷与三七有效成分配伍可降低Caspase-3 蛋白的表达量，抑制CIRI小鼠海马 CA1 区神经细胞凋亡，发挥神经保护作用[10]。本实验也证实黄芪甲苷可降低氧糖剥夺/复氧复糖所致PC12细胞Caspase-3 蛋白的表达增多，从而抑制细胞凋亡，提升细胞存活率。

脑缺血再灌注损伤继发于脑卒中恢复血液灌注之后，其发生机制复杂，病理过程涉及多个环节，包括能量代谢障碍、兴奋性氨基酸释放、胞内钙超载、氧自由基增多、炎性因子释放等，这些因素相互作用、互为因果，最终导致神经细胞的凋亡和坏死，进而出现严重的临床症状及不良预后[11]。目前，对于CIRI的治疗包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、抑制细胞内钙超载及中医药类神经保护措施。近年来中医药治疗以其多靶点、多功效性，在CIRI中的研究逐渐增多。中医理论认为，气虚、血瘀为脑中风发作的病因病机，治疗上宜采用益气活血、祛瘀通络类方药，其中补阳还五汤是中医用于治疗缺血性脑卒中的经典方剂，其使用历史悠久，已逾数千年。黄芪甲苷作为补阳还五汤君药黄芪的主要活性成分之一[12]，具有清除氧自由基、抑制细胞凋亡、抗炎、调节免疫等生物活性[13-15]。多项实验证实，黄芪甲苷对CIRI具有保护作用[5,16]：黄芪甲苷可以改善实验性脑缺血再灌注动物模型的神经功能学评分、缩小其脑梗死体积；同时，在模拟脑缺血再灌注损伤的体外模型中发现，黄芪甲苷可以提升氧糖剥夺/复氧复糖导致的PC12和HT22细胞的存活率，抑制细胞凋亡率，改善细胞生长状态，但其具体机制仍有待进一步研究。

本研究证实黄芪甲苷可通过抑制细胞凋亡发挥对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞的保护作用，机制与促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制促凋亡蛋白Bax和细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶Caspase-3表达有关。本课题将在动物水平和细胞水平进一步探究黄芪甲苷对CIRI的保护作用及机制。