黄芪甲苷对高糖诱导视网膜神经节细胞保护作用的机制

白建民 高菲 胡泊 时伟红

(南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473061)

黄芪为豆科植物黄芪的干燥根部，黄芪甲苷为中药黄芪的主要活性成分，其化学分子式为C41H68O14〔1〕。黄芪甲苷具有广泛的药理活性，特别是抗糖尿病及神经保护作用尤为突出〔2〕。黄芪甲苷可通过抗炎、抗氧化、抗凋亡等途径保护神经损伤〔3〕。氧化应激是体内氧化与抗氧化作用失衡、氧自由基生成过多导致体内组织或细胞出现氧化损伤，其中自由基过多产生是导致神经细胞损伤的关键〔4〕。但黄芪甲苷发挥神经保护作用的具体机制尚未完全清楚。谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，可通过激活其离子型受体产生兴奋性毒性，也可抑制细胞膜上谷氨酸/胱氨酸逆转运子的功能导致氧化性神经损伤，以细胞内活性氧成分升高为主要特征〔5〕。氨基端激酶(JNK)信号通路被认为是介导细胞损伤的重要通路,众多细胞死亡的诱因如氧化应激、炎症介质均以激活JNK为共同通路〔6〕。但其在糖尿病视网膜病中作用机制尚未完全清楚。本研究观察黄芪甲苷对人视网膜神经节细胞RGC-5增殖、凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 人视网膜神经节细胞RGC-5购自ATCC；DMEM培养基、胎牛血清、噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶均购自美国Sellect公司；LipofectamineTM2000、聚氰基丙烯酰正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)试剂盒、ECL发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；谷氨酸(Glu)含量检测试剂盒均购自上海晶抗公司。

1.2细胞培养 采用含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养人视网膜神经节细胞RGC-5，置于37℃，5%CO2培养箱中常规培养。

1.3细胞处理及分组 将对数生长期RGC-5细胞随机分成5组，正常组：不做任何处理的常规培养细胞；高糖组：用50 mmol/L葡萄糖培养液培养24、48、72 h；高糖+黄芪甲苷1组：用50 mmol/L葡萄糖和25 μmol/L黄芪甲苷的培养液培养24、48、72 h；高糖+黄芪甲苷2组：用50 mmol/L葡萄糖和25 μmol/L黄芪甲苷的培养液培养24、48、72 h；高糖+黄芪甲苷3组：用50 mmol/L葡萄糖和100 μmol/L黄芪甲苷的培养液培养24、48、72 h。收集各组培养的细胞用于后续实验。

1.4MTT实验 取适量1.3各组细胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培养4 h，然后弃去上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡，使结晶溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞的增殖力与吸光值呈正比。细胞抑制率=1-A490样品/A490对照。

1.5Annexin V-FITC/PI流式细胞术 将1.3各转染组细胞，用结合缓冲液 500 μl悬浮细胞，分别加入5 μl Annexin V-/FITC和PI，混匀，室温避光静置15 min。采用流式细胞仪测定结果。细胞凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.6Western印迹 取适量对数生长期1.3各组细胞，RIPA裂解后用BCA进行定量，变性离心后取上清进行蛋白上样。按照Western印迹实验常规操作流程进行电泳-转膜-封闭-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-显影曝光。Image J分析目的条带灰度值，以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白表达。

1.7酶联免疫吸附试验(ELISA) 取1.3各组细胞，按照SOD试剂盒、MDA检测试剂盒、Glu含量检测试剂盒说明书要求进行检测。

1.8数据处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1不同浓度黄芪甲苷对高糖诱导RGC-5细胞活力的影响 与正常组相比，高糖组RGC-5细胞在24、48、72 h时细胞活力均显著降低(P<0.05)，与高糖组相比，高糖+黄芪甲苷1、2、3组均显著升高(P<0.05)；且高糖+黄芪甲苷1组显著低于高糖+黄芪甲苷2、3组(P<0.05)，见表1。RGC-5在48 h对黄芪甲苷的浓度变化最敏感，故后续实验选用48 h。

表1 不同浓度黄芪甲苷对高糖诱导RGC-5细胞活力的影响

1)与正常组、2)与高糖组、3)与高糖+黄芪甲苷1组比较:均P<0.05；下表同

2.2不同浓度黄芪甲苷对高糖诱导RGC-5细胞凋亡的影响 与正常组相比，高糖组RGC-5细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，与高糖组相比，高糖+黄芪甲苷1、2、3组均显著降低(P<0.05)，且高糖+黄芪甲苷1组显著高于高糖+黄芪甲苷2、3、组(P<0.05)。见表2。

2.3各组Caspase-3蛋白比较 与正常组相比，高糖组RGC-5细胞Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)；与高糖组相比，高糖+黄芪甲苷1、2、3组均显著降低(P<0.05)，且高糖+黄芪甲苷1组显著高于高糖+黄芪甲苷2、3组(P<0.05)，见表2，图1。

2.4各组SOD和MDA水平比较 与正常组相比，高糖组RGC-5细胞SOD含量显著降低，MDA含量显著升高(P<0.05)；与高糖组相比，高糖+黄芪甲苷1、2、3组SOD含量显著升高，MDA含量显著降低(P<0.05)，且高糖+黄芪甲苷1组SOD含量显著低于高糖+黄芪甲苷2、3组，MDA含量显著高于高糖+黄芪甲苷2、3组(P<0.05)。见表2。

2.5各组Glu含量比较 与正常组相比，高糖组RGC-5细胞Glu含量显著升高(P<0.05)，与高糖组相比，高糖+黄芪甲苷1、2、3组显著降低，且高糖+黄芪甲苷1组显著高于高糖+黄芪甲苷2、3组(P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度黄芪甲苷对高糖诱导RGC-5细胞凋亡、Caspase-3蛋白、SOD和MDA水平及Glu释放的影响

2.6黄芪甲苷通过JNK通路抑制高糖诱导RGC-5细胞的损伤 与正常组相比，高糖组p-JNK蛋白表达显著升高(P<0.05)，高糖+黄芪甲苷1、2、3组p-JNK蛋白表达显著降低(P<0.05)；与高糖+黄芪甲苷1组相比，高糖+黄芪甲苷2、3组p-JNK蛋白表达显著降低(P<0.05)。各组JNK蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表3。

1～5：正常组，高糖组，高糖+黄芪甲苷1组，高糖+黄芪甲苷2组，高糖+黄芪甲苷3组图1 检测RGC-5细胞中Caspase-3蛋白表达

组别p-JNK蛋白JNK蛋白正常组0.23±0.030.82±0.07高糖组0.51±0.051)0.76±0.08高糖+黄芪甲苷1组0.41±0.042)0.83±0.06高糖+黄芪甲苷2组0.31±0.032)3)0.80±0.09高糖+黄芪甲苷3组0.33±0.042)3)0.84±0.08F/P值22.640/0.0000.510/0.730

3 讨 论

黄芪甲苷是黄芪的主要活性化合物，具有强大的抗氧化活性和对周围神经病变进展的保护作用〔7,8〕。Ding等〔9〕发现，黄芪甲苷作为视网膜醛糖还原酶抑制剂，可阻止细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化和失活核因子(NF)-κB信号通路，以减轻db/db小鼠糖尿病视网膜病中的RGCs功能障碍。Hao等〔10〕用过氧化氢(H2O2)诱导RGC-5细胞氧化应激损伤发现，黄芪甲苷能够增加细胞存活率并降低凋亡，降低H2O2诱导的活性氧水平，抑制H2O2诱导的线粒体膜电位降低，降低H2O2诱导的细胞色素c释放，抑制Bax和Caspase-3的表达，增加Bcl-2的表达，提示黄芪甲苷对视网膜神经节细胞中H2O2诱导的氧化应激具有潜在的保护作用。郝明等〔11〕发现，黄芪甲苷处理的高葡萄糖诱导的RGC-5细胞可明显增加细胞存活率，部分抑制高糖诱导的细胞凋亡，提高线粒体膜电位，减轻线粒体肿胀，提示黄芪甲苷可以保护RGC-5细胞免受高葡萄糖诱导的损伤，使糖尿病视网膜病患者受益。本研究结果发现，黄芪甲苷可促进细胞增殖，抑制凋亡，降低Glu的兴奋毒性及失活JNK信号通路。

JNK信号传导是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一个组成部分，其经典靶标即转录因子JUN已被证明可调节与视网膜神经退行性病变相关的多种生物学过程,尤其是糖尿病视网膜病〔12～15〕。Kim等〔16〕阐明，JNK信号通路可作为治疗视网膜疾病的潜在治疗靶点。Lv等〔17〕研究报道，中药葛根素可保护天冬氨酸(NMDA)诱导的视网膜神经节细胞损伤，可降低ROS和MAD水平，促进SOD和NO的产生，并下调RGCs中nNOS和iNOS的表达，其机制可能为葛根素抑制Bax、Caspase-3的表达，抑制JNK和p38磷酸化，提示葛根素可通过JNK/p38 MAPK途径保护NMDA诱导的细胞凋亡和RGCs损伤。