黄芪甲苷对肾癌细胞系（769-P）增殖、凋亡的影响

施志超

肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，起源于肾小管上皮细胞，约占肾脏肿瘤的90%，其发病率仅次于膀胱癌，为泌尿系肿瘤发病率中的第二位，在过去的几十年中，其发病率逐年上升，在所有成人恶性肿瘤中占5%左右[1]。肾癌的治疗过程中存在对放化疗不敏感、术后预后差等问题。随着中药学的发展，众多中药被应用于肿瘤的治疗[2]，相比传统的化疗药物，中药具有多靶点、药物毒副作用小等优势[3]。黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ）是从黄芪提取的物质之一，也是众多单体中活性较强的成分之一[4]。研究表明，黄芪有抗肝癌细胞等作用[5]。本研究通过检测黄芪甲苷对769-P 细胞的细胞活性、活性氧（ROS）、线粒体膜电位和胱天蛋白酶3/9（Caspase 3/9）活性的影响，旨在研究黄芪甲苷抗肾癌的活性及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人源肾癌细胞（769-P）（上海中科院细胞库）。

1.2 主要试剂和仪器 RPMI 1640 培养基（Gibco公司，8120481）；胎牛血清（Gibco 公司，42G5093K）；ROS 检测试剂盒（碧云天生物科技公司，100620201106）；线粒体膜电位检测试剂盒（碧云天生物科技公司，032421210013）；CCK-8 试剂盒（碧云天生物科技公司，010919190109）；啶磷脂酰丝氨酸蛋白抗体偶联荧光标记物FITC（Annexin V-FITC）细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物科技公司，062719190909）；Caspase 3 活性检测试剂盒（碧云天生物科技公司，071018190112）；Caspase 9 活性检测试剂盒（碧云天生物科技公司，060618200410）；黄芪甲苷（纯度≥98%，阿拉丁生化科技公司，2007264）。CO2培养箱（日本PHCbi 公司），流式细胞仪（美国BD 公司），酶标仪（瑞士Tecan 公司），高速低温离心机（美国Thermo 公司）。

1.3 方 法

1.3.1 人源肾癌细胞（769-P）在标准细胞培养条件（37 ℃，5% CO2）下，RPMI 1640 培养基添加10%胎牛血清，1% GlutaMAX 和100 μ/mL 青霉素-链霉素。用含有EDTA 的胰酶消化，按1∶4 传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 细胞增殖能力检测 使用CCK-8 检测细胞的增殖能力。769-P 细胞接种到96 孔板，贴壁生长24 h，使用0、5、10、20、40 和80 μM 的黄芪甲苷溶液共同孵育48 h 后，每孔加入10μL CCK-8 试剂，培养箱内孵育1 h 后进行检测，使用酶标仪检测450 nm 处的吸光度。以0 μM 黄芪甲苷溶液组作为对照组，计算各组769-P 细胞活性。

1.3.3 细胞ROS 水平检测 流式细胞仪检测细胞ROS 水平。取对数生长期细胞置于6 孔板中（3×105个/孔）用于实验，待细胞贴壁生长24 h 后，加入黄芪甲苷溶液（0、10、20 和40 μM）共同孵育24 h 后，每孔加入1 mL DCFH-DA（1∶1000 稀释）探针进行染色，放入培养箱孵育20 min，使用PBS 洗去探针染色，使用流式细胞仪检测探针荧光强度（ROS 水平）。

1.3.4 细胞线粒体膜电位水平检测 流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位水平。取对数生长期细胞置于6孔板中（3×105个/孔）用于实验，待细胞贴壁生长24 h 后，加入黄芪甲苷溶液（0、10、20 和40 μM）共同孵育24 h 后，每孔使用1 mL JC-1 探针染色液体进行染色，放入培养孵育20min 后，使用染色缓冲液（1×）清洗2 次，使用流式细胞仪分别检测线粒体膜电位水平。

1.3.5 诱导细胞凋亡检测 流式细胞仪检测细胞凋亡情况。取对数生长期细胞置于6 孔板中（3×105个/孔）用于实验，待细胞贴壁生长24 h 后，加入黄芪甲苷溶液（0、10、20 和40 μM）共同孵育48h。每孔使用5 μL Annexin V FITC 和10 μL PI 双染法染色，避光反应20 min，PBS 洗涤2 次后，流式细胞仪检测细胞凋亡比例变化。

1.3.6 Caspase 3 和Caspase 9 活性检测 采用分光光度法检测Caspase 3 和Caspase 9 活性。取对数生长期细胞置于6 孔板中（1×106个/孔），待细胞贴壁生长24 h 后，加入黄芪甲苷溶液（0，10，20 和40 μM）共同孵育48 h，收齐细胞，4 ℃离心10 min 后去除上清液，每管细胞加入100 μL 裂解液冰上裂解15 min 后，取裂解液50 μL 和检测缓冲液40 μL、检测试剂10 μL 在37 ℃孵育60 min，使用酶标仪在405 nm处的吸光度值，计算Caspase 3 和Caspase 9 活性。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件。所有正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较作Dunnett’s检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪甲苷对769-P 细胞增殖活性的影响 使用CCK-8 检测黄芪甲苷对769-P 细胞增殖活性的影响。结果表明，与空白对照组比较，在5～80 μM 浓度范围内，经黄芪甲苷处理48 h 后，以浓度依赖性的方式抑制769-P 细胞增殖活性，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

表1 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞生长影响（%，）

表1 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞生长影响（%，）

注：与0 μM 黄芪甲苷比较，aP＜0.05，bP＜0.01

2.2 黄芪甲苷对ROS 水平的影响 使用DCFH-DA探针检测黄芪甲苷促进769-P 细胞产生的ROS。在不同浓度的黄芪甲苷作用于769-P 细胞24h 后，与对照组比较，荧光强度明显上升，结果表明，黄芪甲苷以剂量依赖性方式增加ROS 产生，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表2、图1。

表2 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞ROS 水平影响（荧光强度，）

表2 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞ROS 水平影响（荧光强度，）

注：ROS 为活性氧；FL1-A 为JC-1 单体；与0 μM 黄芪甲苷比较，aP＜0.05，bP＜0.01

2.3 黄芪甲苷对线粒体膜电位的影响 使用JC-1探针检测黄芪甲苷对769-P 细胞线粒体膜电位的影响。在不同浓度的黄芪甲苷作用于769-P 细胞24 h后，与对照组比较，黄芪甲苷处理组的绿色荧光（JC-1 单体）与红色荧光（JC-1 聚合物）的比值升高，黄芪甲苷处理后，769-P 细胞的线粒体膜电位下降，黄芪甲苷能以剂量依赖的方式降低769-P 细胞线粒体膜电位，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表3、图2。

表3 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞线粒体膜电位的影响（荧光强度比值（）

表3 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞线粒体膜电位的影响（荧光强度比值（）

注：FL1-A 为JC-1 单体；FL2-A 为JC-2 单体；与0 μM 黄芪甲苷比较，aP＜0.05，bP＜0.01

2.4 黄芪甲苷对线粒体膜电位的影响 Annexin V FITC/PI 双染法检测黄芪甲苷对769-P 细胞凋亡的影响。不同浓度的黄芪甲苷作用于769-P 细胞48 h后，Annexin V FITC/PI 双染法检测结果显示（Q1 代表坏死细胞，Q2 代表晚期细胞，Q3 代表早期凋亡细胞，Q4 代表正常细胞），与对照组比较，黄芪甲苷处理组凋亡比例明显增加（Q2+Q3），表明黄芪甲苷能诱导769-P 细胞凋亡，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图3。

表4 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞凋亡率的影响（%，）

表4 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞凋亡率的影响（%，）

注：与0 μM 黄芪甲苷比较，aP＜0.05

2.5 黄芪甲苷对Caspase 3/9 活性的影响 使用酶标仪检测黄芪甲苷对769-P 细胞Caspase 3/9 活性的影响。在不同浓度的黄芪甲苷作用于769-P 细胞48 h 后，结果表明，黄芪甲苷能以剂量依赖的方式促进Caspase 3/9 活性升高，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表5。

表5 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞Caspase 3和Caspase 9 的影响（相对活性，）

表5 不同浓度黄芪甲苷对769-P 细胞Caspase 3和Caspase 9 的影响（相对活性，）

注：Caspase 3 为胱天蛋白酶3；Caspase 9 为胱天蛋白酶9；与0 μM黄芪甲苷比较，aP<0.05，bP<0.01

3 讨论

目前治疗肾癌以手术治疗和化疗为主[6]，但是传统的化疗已经不能满足临床治疗的需求，因此探寻新的治疗肾癌的药物成为新的热点之一。过量产生ROS，导致氧化应激是众多抗肿瘤药物的机制之一[7]。ROS 不仅直接攻击脂质、蛋白质和DNA，导致线粒体膜电位的下降，并充当诱导细胞凋亡的信号通路的上游信号分子之一[8]。

本研究结果表明，与空白对照组（0 μM 黄芪甲苷）比较，黄芪甲苷处理组能显著地以浓度依赖性的方式抑制769-P 的增殖活性，降低细胞的存活率，具有抗肿瘤活性。在肿瘤细胞死亡的方式中，凋亡是其中主要的死亡方式之一[9]，同时细胞凋亡是细胞毒性中一个非常重要的现象。细胞凋亡是一个高度调控的过程，而在化疗过程中产生的肿瘤凋亡通常是由于化疗药物使用诱导细胞凋亡的产生[10]。它是由两个主要的细胞死亡信号通路触发，死亡受体介导（外源性）和线粒体（内源性）信号通路[11]。线粒体膜电位的下降，导致细胞色素c 从线粒体释放到细胞质中，随后激活Caspase 9[12]。Caspase 9 的激活导致Caspase 3 的激活，切割特定底物以执行凋亡。本研究表明，与0 μM 黄芪甲苷组比较，10、20 和40 μM 黄芪甲苷处理组的荧光明显上升，差异有统计学意义（P<0.05 或P<0.01），说明黄芪甲苷能促进769-P 细胞内ROS 的水平升高，细胞内的ROS 异常升高，会促进细胞凋亡的发生。本研究采用JC-1 探针检测线粒体膜电位的情况，发现黄芪甲苷能显著降低769-P 的线粒体膜电位，这也进一步说明黄芪甲苷导致的ROS 升高进一步影响到线粒体的膜电位，诱导细胞凋亡[13]。本研究通过Annexin V FITC/PI 双染对黄芪甲苷诱导细胞凋亡进行研究，发现黄芪甲苷10、20 和40 μM处理组的早期凋亡和晚期凋亡比例呈现浓度依赖性增加，而坏死区域的细胞比例无明显变化，进一步说黄芪甲苷诱导769-P 细胞死亡的主要方式是凋亡而并非坏死。在黄芪甲苷处理组Caspase 3/9 相对活性呈现浓度依赖性增加，表明黄芪甲苷能显著提高Caspase 3/9 的活性，Caspase 3/9 作为线粒体凋亡途径中的标志性蛋白，参与到细胞凋亡过程中，表明黄芪甲苷诱导细胞凋亡的分子机制可能与激活Caspase 通路有关。作为传统中药植物黄芪的主要活性成分，黄芪甲苷在本研究中具有显著的体外抗肾癌细胞系769-P 的活性，其原因可能是与促进细胞内ROS 的产生，降低膜电位导致线粒体损伤有关。

总之，黄芪甲苷可抑制肾癌细胞系769-P 的增殖活性，促进ROS 水平升高，降低线粒体膜电位，诱导细胞凋亡，其分子机制可能与激活Caspase 通路有关。