土茯苓总黄酮治疗自身免疫性前列腺炎模型大鼠作用机制研究

盛 涛 马天红 严礼剑 邵 欢 王晓庭 赫艳梅

慢性前列腺炎是常见的男性泌尿系统疾病，影响患者生活质量。土茯苓味甘、淡，性平，有解毒、除湿、通利关节之功效，主要用于筋骨疼痛、湿热淋浊、带下、痈肿、瘰疬、疥癣[1]。研究表明，土茯苓具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎镇痛、改善微循环等作用[2]。慢性前列腺炎在中医属“精浊”范畴，其病机主要为湿热、肾虚、瘀血[3]。临床观察表明，湿热瘀阻型慢性前列腺炎最为多见[4]。本实验检测SD 大鼠前列腺组织IL-1β、IL-6 和TNF-α 浓度，结合前列腺组织的病理学，探讨土茯苓总黄酮对自身免疫性前列腺炎模型大鼠的干预作用及机制。

1 实验材料

1.1 动 物 8 周龄雄性SD 大鼠60 只，SPF 级，体质量200～220 g[上海斯莱克，SCXK（沪）2013-0016]；饲养环境：浙江中医药大学动物实验研究中心[SYXK（浙）2018-0012]；温度（22±2）℃，湿度50%～60%，采用12 h 昼夜节律，自由饮水与进食下饲养。实验开始前大鼠进行适应性喂养1 周，实验完全遵照动物实验的伦理要求进行。

1.2 药 物 土茯苓（浙江国药有限公司，批号20190049）；土茯苓总黄酮对照品（武汉中标科技有限公司，批号CFN98643）；阿司匹林片（丹东医创药业有限公司，批号20190501）；百白破疫苗（成都生物制品研究所，批号S10970019）。

1.3 试 剂 Mouse IL-1beta Platinum Elisa（美国eBioscience 公司，批号147435043），Mouse IL-6 Platinum Elisa（美国eBioscience 公司，批号145466066），Mouse TNF-alpha Platinum Elisa（美国eBioscience公司，批号147819025）。10%甲醛（苏州市三杰化学品科技有限公司，批号20160418）；曙红Y 生物染色剂（国药集团化学试剂有限公司，批号20140909）；无水苏木色精（国药集团化学试剂有限公司，批号20171A）；水为超纯水，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.4 主要仪器 MR-4100 酶标仪（美国Dynatech 公司）；D-37520 高速低温离心机（赛默飞世尔科技公司）；ASP300S 全自动组织脱水机（Leica 公司）；RM2235 石蜡切片机（Leica 公司）；DM3000 LED 显微镜（Leica 公司）；BT125d 电子天平（Sartorius 公司）。

2 实验方法

2.1 供试药物制备 土茯苓总黄酮由本实验室提取[5]。取土茯苓饮片粉碎后过筛，75%乙醇溶剂浸泡30 min，采用300 W/55 kHz 超声波辅助提取20 min，提取液旋蒸后冷冻干燥，得到土茯苓提物。采用高效液相色谱（HPLC）测定土茯苓提物中总黄酮（TFSG）成分含量[1]。

2.2 造模与分组 采用纯化前列腺蛋白刺激法制备大鼠自身免疫性前列腺炎模型[6]，SD 大鼠60 只，经过7 d 适应性喂养后按照随机数字表法分成空白组、模型组、阿司匹林组、土茯苓总黄酮低、中、高剂量组，每组10 只。将大鼠麻醉后，腹腔注射百白破疫苗0.5 mL，皮下多点注射前列腺蛋白提纯稀释液与完全弗氏佐剂（FCA）混合乳剂（1∶1 体积）1 mL。30 d 后，重复1 次，即可诱导产生大鼠自身免疫性前列腺炎症，对照组注射等体积生理盐水。造模成功后按剂量低中高组分别灌胃100、300 及500 mg/kg 的土茯苓总黄酮，空白组、模型组给予相同体积生理盐水，阿司匹林组给予100 mg/kg 阿司匹林混悬液[7]，每天1次，连续给药15 d。实验结束后于末次灌胃2 h 后脱颈处死大鼠，解剖分离大鼠前列腺组织为测定样本。

2.3 ELISA 法测定前列腺组织匀浆IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平 取样本前列腺组织，加入0.5 mL 预冷的生理盐水，组织均浆仪均浆，置于1.5 mL EP 离心管中，2000 r/min 低温离心15 min 后移液枪收集上清液。分别按试剂盒说明书测定其IL-1β、IL-6、TNF-α 的ELISA 浓度，以计算大鼠前列腺炎性因子生成抑制率。炎性因子生成抑制率=（模型组炎性细胞因子表达－阿司匹林组炎性细胞因子表达）/模型组炎性细胞因子表达×100%。

2.4 HE 染色检测大鼠前列腺组织病理学 大鼠前列腺组织10%甲醛溶液固定72 h 后石蜡包埋，切片（厚度4 μm），HE 染色后观察病理变化，以评估前列腺炎症情况。

2.5 统计学方法 应用SPSS 25.0 软件处理数据；数据分析采用回归/拟合计算软件处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示；多组间比较使用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行检验，两两比较采用SNK 检验方法，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 土茯苓总黄酮对前列腺组织匀浆IL-1β、IL-6和TNF-α 水平的影响 与空白组比较，各实验组大鼠前列腺组织IL-1β 水平明显增加，差异有统计学意义（P 均＜0.05）；土茯苓总黄酮低剂量组和模型组IL-6 水平明显高于空白组（P＜0.05）；土茯苓总黄酮低剂量组及模型组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；阿司匹林组与空白组TNF-α 水平相近（P＞0.05），其余四组TNF-α 水平均高于空白组（P 均＜0.05）；与模型组比较，除土茯苓总黄酮低剂量组外，其余各实验组IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明显下降，差异有统计学意义（P 均＜0.05）；土茯苓总黄酮高剂量组IL-6 水平与阿司匹林组相近（P＞0.05）。土茯苓总黄酮低、中、高剂量组间IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠前列腺组织匀浆IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比较（ng/L，）

表1 各组大鼠前列腺组织匀浆IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比较（ng/L，）

注：空白组和模型组予生理盐水灌胃；土茯苓总黄酮低、中、高剂量组分别予100、300 及500 mg/kg 的土茯苓总黄酮溶液灌胃；阿司匹林组给予100 mg/kg 阿司匹林溶液灌胃；IL-1β 为白细胞介素1β；IL-6 为白细胞介素6；TNF-α 为肿瘤坏死因子α；与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与总黄酮中剂量组比较，cP＜0.05；与总黄酮高剂量组比较，dP＜0.05

3.2 土茯苓总黄酮对模型大鼠前列腺形态组织学影响 空白组大鼠前列腺其腺腔结构完整，腺泡上皮细胞一般为单层柱状或立方状上皮，腺腔形态不一，无或少量炎性细胞浸润及水肿。模型组大鼠前列腺存在部分腺腔萎缩，基底膜破坏严重，腺上皮多为扁平状，腺腔内分泌物显著减少，大量炎性细胞浸润及水肿，可见大量成纤维细胞。阿司匹林及土茯苓高剂量组镜下表现相近，其前列腺组织趋于正常，前列腺腺腔结构完整，腺泡上皮可见少量增生，存在少量炎性细胞浸润，偶见成纤维细胞。土茯苓中剂量组大鼠前列腺腺体组织少部分腺腔萎缩，少部分基底膜被破坏，少量炎性细胞浸润，可见少量成纤维细胞。土茯苓低剂量组大鼠前列腺组织部分腺腔萎缩，基底膜部分破坏，较多的炎性细胞浸润及纤维组织增生。见图1。

4 讨论

研究表明，炎症因子在自身免疫性前列腺炎的病理机制中起到非常关键的作用[8]；其中，IL-1β 和TNF-α 是自身免疫性前列腺炎的病理发展过程中的重要促炎因子，而IL-6 则能够调节IL-2 及IL-1β和TNF-α 的合成[9]。

一般认为，IL-1β 作为最经典的炎症调节剂，是炎症调节的始动因素[10]。本实验模型组大鼠前列腺组织IL-1β 表达明显上调，土茯苓总黄酮各组及阿司匹林组前列腺组织IL-1β 表达存在不同程度的下降。这进一步证明了自身免疫性前列腺炎造模行为激活了炎性反应的发生，使IL-1β 表达上调，从而促使前列腺组织炎症进展。IL-6 在自身免疫性前列腺炎的炎症进展过程中发挥着重要的作用，慢性前列腺炎前列腺腺体组织IL-6 表达明显升高[9]。本实验中，模型组前列腺组织IL-6 的明显升高，表明土茯苓总黄酮高剂量组及中剂量组对前列腺组织IL-6有不同程度的抑制作用，其中，土茯苓总黄酮高剂量组与阿司匹林组的抑制水平接近。

研究证明，TNF-α 等炎症因子在身免疫性前列腺炎患者体内呈现过高的表达[11]。本实验发现，模型组大鼠前列腺组织TNF-α 明显上升，土茯苓总黄酮低、中、高剂量组及阿司匹林组TNF-α 表达均明显下降（P 均<0.05），表现为相对较低的TNF-α 水平。表明土茯苓总黄酮能明显降低TNF-α 表达。

综上所述，本实验结果显示，土茯苓总黄酮能降低自身免疫性前列腺炎模型大鼠前列腺组织IL-1β、IL-6 及TNF-α 表达水平，改善前列腺病理形态，从而减轻前列腺组织的炎症反应。