黄芪甲苷通过调控Keap1-Nrf2-ARE信号通路减轻PM2.5诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤

赵颖丹，张天嵩，马 骏，张伟伟，易 扬，顾 波，王汉清，宣 怡

(上海市静安区中心医院 复旦大学附属华山医院静安分院肾内科，上海 200040)

在大气颗粒物中，细颗粒物2.5(particulate matter 2.5，PM2.5)占有较大比例，由于PM2.5具有较大的比表面积，其更易吸附重金属和有机物，进而损伤人体健康[1-2]，因而具有更高的毒性。最近的研究表明，PM2.5很容易通过肺泡上皮细胞进入循环系统，最终破坏心血管系统和肾脏[3-5]。如Zhang等[6]研究发现，短期暴露PM2.5加重氧化应激和炎症反应，从而促进BALB/c小鼠肾脏损伤。Yang等[7]同样发现，PM2.5能够激活核因子红细胞相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血红素氧化酶-1(heme oxygenase 1, HO1)通路，进而加重人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤。因此，抑制氧化应激将有助于减轻PM2.5导致的肾损伤。黄芪甲苷是从常见中药黄芪中提取的活性成分。Gui等[8]学者报道，黄芪甲苷可通过抑制凋亡途径和氧化应激通路预防缺血引起的急性肾损伤。由此推测，黄芪甲苷可能有助于减轻PM2.5诱导的肾脏氧化损伤。因此，本研究通过体外实验探究黄芪甲苷在抑制PM2.5诱导的肾脏氧化损伤中的作用及其分子机制，以期为PM2.5所致肾脏氧化损伤的治疗提供帮助。

1 材料

1.1 试剂 HK-2细胞购：中国科学院细胞库；DMEM和F12培养液：美国Thermo Fisher Scientific公司；黄芪甲苷：南京春秋生物工程有限公司；Western blot相关试剂、Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒、CCK8试剂盒、BeyoClickTMEdU-488细胞增殖检测试剂盒和一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；RIPA裂解液：上海雅吉生物科技有限公司；总活性氧(reactive oxygen species，ROS)分析试剂盒：Sigma Aldrich；抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)检测试剂盒：R&D Systems；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量检测试剂盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；羊抗兔二抗：杭州华安生物技术有限公司；兔多克隆一抗：Abcam。

1.2 仪器 BioTek ELx800全自动酶标仪：美国BioTek公司；BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪：美国BD公司；ImageQuant RT ECL凝胶成像系统：美国GE Healthcare公司；TGL-18台式高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；XDS-200D数码电脑型倒置显微镜：苏州景通仪器有限公司；TSP/PM10/PM2.5颗粒物大流量采样器：青岛精诚仪器仪表有限公司；全自动超声波清洗机：深圳市深力劲超声波自动化设备有限公司。

2 方法

2.1 PM2.5的采集 PM2.5采集于上海市静安区中心医院、华山医院静安分院；通过PM2.5大流量采样器对PM2.5进行连续采样(流量：1.05 m3/min；时间：22 h)。对采样后的滤膜称质量，并裁剪为1 cm×1 cm，浸泡去离子水的同时进行超声振荡(每次0.5 h，共3次)，随后对洗提液进行6层纱布过滤，滤液经真空干燥后制成粉末，经紫外线照射杀菌0.5 h后，通过磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)配制成5 mg/mL的PM2.5悬液，使用前超声振荡15 min。

2.2 细胞分组 HK-2细胞培养基为含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养液；培养条件：5% CO2和37 ℃，汇合度70%～80%时消化，并按1∶4比例传代培养。黄芪甲苷用PBS制成500 nmol/L的溶液。将HK-2细胞分为5组：对照组(仅PBS处理)、模型组(200 μg/mL PM2.5处理24 h)、黄芪甲苷低剂量组(200 μg/mL PM2.5及10 nmol/L黄芪甲苷共同处理24 h)、黄芪甲苷中剂量组(200 μg/mL PM2.5以及100 nmol/L黄芪甲苷共同处理24 h)、黄芪甲苷高剂量组(200 μg/mL PM2.5以及200 nmol/L黄芪甲苷共同处理24 h)。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 HK-2细胞经消化、离心、清洗后依次添加结合缓冲液(100 μL)、Annexin-Ⅴ-FITC(20 ng/L，10 μL)，在避光条件下孵育(37 ℃)0.5 h，随后添加PI(50 ng/L，5 μL)，在避光条件下孵育(37 ℃)5 min，接着添加结合缓冲液(0.4 mL)，并迅速通过BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪检测凋亡率。

2.4 CCK8测定细胞增殖能力 1×106/mL HK-2细胞接种于96孔板中(每孔0.1 mL)，12 h后，更换含10% CCK8试剂的培养基0.1 mL，培养(37 ℃，避光条件下)2～3 h后，最后通过BioTek ELx800全自动酶标仪测定450 nm处的吸光值。

2.5 TUNEL染色检测细胞凋亡 各组HK-2细胞接种于铺有盖玻片的6孔板内，浓度l×108/mL，培养过夜后给予各组相应处理，经4%多聚甲醛固定1 h后，PBS洗涤并添加3% H2O2封闭10 min；经0.1% Triton X-100柠檬酸钠通透液孵育120 s后，添加TUNEL反应液并孵育60 min，经洗涤后添加POD转换液并孵育(避光)30 min，接着添加DAB底物并且孵育10 min，最后封片并且在显微镜下观察和分析。

2.6 EdU标记实验测定细胞增殖能力 将4×103/mL HK-2细胞接种于96孔板中，12 h后，添加0.1 mL含EdU的培养基，孵育2 h，进行多聚甲醛固定以及Triton X-100通透处理，接着添加0.1 mL的Apollo染色反应液，封片后通过BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪检测细胞增殖能力。

2.7 Western blot检测总Nrf2、核Nrf2、HO1、NQO1表达水平 经RIPA裂解液裂解30 min后,收集上清并检测总蛋白浓度,然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转膜并封闭。接着孵育一抗过夜,包括Nrf2抗体(1∶500稀释)、NAD(P)H醌脱氢酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1，NQO1]抗体(1∶500稀释)、HO-1抗体(1∶500稀释)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体(1∶1 000稀释)；洗膜后孵育羊抗兔二抗(1∶2 000稀释),2 h后添加电化学发光反应底物,暗室曝光后扫描底片,最后计算灰度值。

2.8 氧化应激指标检测 将不同处理的HK-2细胞进行裂解，然后将上清液在冷的线粒体分离缓冲液中进行摇匀。使用ROS分析试剂盒、MDA含量检测试剂盒检测ROS和MDA水平；采用总SOD活性检测试剂盒、GSH-px检测试剂盒检测GSH-px与SOD，详细操作按照试剂盒说明书进行。

3 结果

3.1 黄芪甲苷减轻PM2.5诱导的肾小管上皮细胞损伤 流式细胞仪分析结果(图1)显示，PM2.5处理导致肾小管上皮细胞凋亡比例明显增加，而给予黄芪甲苷处理后，凋亡率明显降低(P<0.05)；随着黄芪甲苷浓度的提高，肾小管上皮细胞凋亡比例逐步降低。进一步行TUNEL染色，检测结果(图2)显示与流式细胞仪分析结果相似的趋势。随后观察黄芪甲苷对肾小管上皮细胞HK-2细胞增殖的影响。EdU细胞增殖检测结果(图3)显示，PM2.5处理显著抑制肾小管上皮细胞增殖(P<0.05)，而黄芪甲苷处理后，HK-2细胞增殖能力明显增强(P<0.05)；随着黄芪甲苷浓度的提高，HK-2细胞增殖能力逐步增强。CCK8检测结果显示同样的趋势(图4)。

注：A.对照组；B.模型组；C.黄芪甲苷低剂量组；D.黄芪甲苷中剂量组；E.黄芪甲苷高剂量组；与对照组比较，*P#P△P◇P<0.05

注：A.对照组；B.模型组；C.黄芪甲苷低剂量组；D.黄芪甲苷中剂量组；E.黄芪甲苷高剂量组；与对照组比较，*P#P△P◇P<0.05

注：A.对照组；B.模型组；C.黄芪甲苷低剂量组；D.黄芪甲苷中剂量组；E.黄芪甲苷高剂量组；与对照组比较，*P#P△P◇P<0.05

注：A.对照组；B.模型组；C.黄芪甲苷低剂量组；D.黄芪甲苷中剂量组；E.黄芪甲苷高剂量组；与对照组比较，*P#P△P◇P<0.05

3.2 黄芪甲苷抑制氧化应激反应 本研究对氧化应激反应进行检测发现，PM2.5处理导致HK-2细胞ROS、MDA水平显著提高(P<0.05)，而抗氧化酶SOD、GSH-Px水平均明显降低(P<0.05)。给予黄芪甲苷处理后，PM2.5处理导致的ROS和MDA水平升高被显著抑制，且随黄芪甲苷处理浓度的增加，ROS和MDA水平不断降低。进一步对抗氧化酶进行检测发现，与模型组比较，黄芪甲苷处理后抗氧化酶SOD和GSH-Px水平明显升高(P<0.05)，且随黄芪甲苷处理浓度的增加，SOD和GSH-Px水平不断升高。见表1。

3.3 黄芪甲苷对Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-Nrf2-抗氧化反应元件(antioxident response element, ARE)信号通路的影响 本研究对氧化应激相关信号通路Keap1-Nrf2-ARE进行检测发现，与对照组比较，PM2.5处理后总Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1水平显著降低(P<0.05)，而给予黄芪甲苷处理后，总Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1水平明显升高(P<0.05)，且随黄芪甲苷浓度的升高而升高。结果见图5和表2。

表1 黄芪甲苷对HK-2细胞ROS、MDA、SOD、GSH-Px水平的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与黄芪甲苷低剂量组比较，△P<0.05；与黄芪甲苷中剂量组比较，◇P<0.05

4 讨论

研究显示，PM2.5具有表面积较大、粒径较小、含有较多有害物质且在空气中漂浮时间长的特点，因而具有长距离传输的能力[9-10]。研究发现，PM2.5是由金属(砷、铅)、有机物(多环芳烃、有机碳)、微生物(真菌孢子、细菌)等成分组成的复杂混合物。这种颗粒非常小，很容易沉积在肺泡中[7,11]。最近的研究表明，PM2.5很容易通过肺泡上皮细胞进入循环系统，最终破坏心血管系统和肾脏[12-13]。因此，抑制PM2.5所致肾脏损伤也成为学者关注的焦点。本研究结果显示，PM2.5处理后，肾小管上皮细胞凋亡率明显增加；而给予黄芪甲苷处理后，细胞凋亡率明显下降。这表明黄芪甲苷能够抑制PM2.5所致肾小管上皮细胞凋亡。进一步检测细胞增殖情况发现，经PM2.5处理的肾小管上皮细胞增殖力明显降低，而经黄芪甲苷处理后，细胞增殖力则明显高于模型组。结果说明黄芪甲苷处理有助于促进肾小管上皮细胞增殖。因此，黄芪甲苷的应用有助于PM2.5所致肾脏损伤的治疗。

注：A.对照组；B.模型组；C.黄芪甲苷低剂量组；

表2 黄芪甲苷对Keap1-Nrf2-ARE信号通路相关蛋白相对表达水平的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与黄芪甲苷低剂量组比较，△P<0.05；与芪甲苷中剂量组比较，◇P<0.05

PM2.5所致氧化应激是其诱导生物学效应的关键机制[13-14]。如Hu等[15]研究显示，PM2.5暴露可激活HaCaT角质形成细胞的氧化应激反应和线粒体凋亡，导致皮肤刺激和损伤。因此，本研究从氧化应激方面进一步探究黄芪甲苷减轻PM2.5所致肾小管上皮细胞损伤的分子机制。结果显示，PM2.5处理后，HK-2细胞ROS和MDA水平显著升高，同时SOD、GSH-Px水平均明显降低，说明PM2.5导致肾小管上皮细胞损伤是由氧化应激反应加重导致的。肾小管上皮细胞给予PM2.5和黄芪甲苷共同处理后，进一步检测指标表明，ROS、MDA水平均显著低于PM2.5处理的HK-2细胞，而SOD、GSH-Px水平显著高于PM2.5处理的HK-2细胞。由此确定黄芪甲苷减轻PM2.5所致肾小管上皮细胞损伤是由抑制氧化应激反应实现的。这与Yan等[16]的研究——黄芪甲苷通过抑制氧化应激反应减轻顺铂所致急性肾损伤的结果相近。

Keap1-Nrf2-ARE通路在氧化应激中作用明显。Nrf2通过与ARE、Keap1相互作用，进而启动下游解毒酶以及抗氧化蛋白的基因表达，展示出细胞保护作用[17-19]。因此，本研究探究了黄芪甲苷对Nrf2、HO1、NQO1表达的调控作用。结果显示，肾小管上皮细胞经黄芪甲苷处理后，总Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1的表达水平均明显升高；进一步分析发现，随着黄芪甲苷浓度的增加，总Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1表达水平不断升高。这说明黄芪甲苷的抗氧化作用是通过Keap1-Nrf2-ARE通路实现的，并且黄芪甲苷处理能够促进Nrf2入核。目前多项研究报道了黄芪甲苷等中药提取物在抗氧化应激中的作用[20-21]。如黄存东等[22]发现，黄芪甲苷通过调控Keap1-Nrf2-ARE通路保护肾小球系膜细胞免受高糖环境的损伤。然而黄芪甲苷如何促进Nrf2表达和入核目前尚未完全被阐明。

综上所述，本研究探究了黄芪甲苷对PM2.5所致肾小管上皮细胞损伤的保护作用。结果显示黄芪甲苷能够通过调控Keap1-Nrf2-ARE信号通路抑制氧化应激反应，从而减轻PM2.5诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤。本研究结果将有助于肾小管上皮细胞氧化损伤的治疗，以及为黄芪甲苷的临床应用提供帮助。同时，黄芪甲苷减轻PM2.5所致肾小管上皮细胞氧化损伤的体内研究以及黄芪甲苷作用时间的选择仍需进一步研究。