伸筋草对类风湿性关节炎大鼠踝关节滑膜组织ICAM-1、MMP-3及OPG/RANKL/RANK信号通路的影响

张妍妍，邢希旺，敖鹏，刘玉婕，肖洪彬*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.天津科伦药物研究有限公司，天津 300457)

流行病学研究表明，全球类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)的平均发病率在0.5%～1%之间，而我国大陆地区类RA的发病率为0.42%[1]。尽管从发病率来看，我国属于RA低发病率国家，但是由于我国庞大的人口基数和人口结构的老龄化，近年来我国RA患者逐年增加。RA是一种慢性自身免疫性疾病，以关节炎性病变为主，如不加以控制会导致关节骨组织的损伤、畸形甚至丧失功能[2]。RA的高致残率不仅影响患者本身的生活质量，而且为家庭和社会带来巨大的经济负担。

由于病因尚未完全清晰，因此目前西医无法根治RA，主要以免疫抑制剂和非甾体抗炎药控制症状。中医学在这方面具有独特的优势，研究表明多种天然药物中的活性成分，不仅可以有效缓解RA的症状，而且能够从一定程度上延缓疾病的进展[3-5]。中药伸筋草(Lycopodium Clavatum)为石松科植物，《本草拾遗》中记载：味苦辛，温，无毒。伸筋草归肝、脾、肾经，具有祛风除湿、舒筋活络的功效，中医临床常用于治疗关节酸痛、屈伸不利。现代研究表明，伸筋草具有调节免疫、抗炎镇痛等药理作用[6]。

本研究采用注射弗氏完全佐剂的方法复制大鼠RA模型，通过大鼠滑膜组织HE染色病理变化、细胞间黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、基质金属蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase，MMP-3)的表达以及OPG/RANKL/RANK信号通路来探讨伸筋草治疗RA的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级，健康SD大鼠66只(多备10%的实验动物备用)，5～6月龄，体质量(200±20)g，雄性，饲养环境：12 h-12 h明暗自动切换(7:00—19:00)；温度控制：(25±2)℃；相对湿度控制：45%～75%。所有实验动物均由黑龙江中医药大学GLP实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(吉)-2018-0007。

1.2 主要实验试剂

弗氏完全佐剂(批号：1002036152，西格玛公司)，II型胶原(牛，冻干粉，Chondrex，批号：150342)，兔抗大鼠CD4单抗(广州健仑生物科技有限公司，批号：20170315)，大鼠ICAM-1、MMP-3单抗(碧云天生物，批号：AF2443、AF1618)。

1.3 实验药物

伸筋草总生物碱提取物：实验室自制，取适量加蒸馏水溶解，制得每mL含伸筋草生药量0.054 g的伸筋草提取物浓缩液。

雷公藤多苷片：远大医药黄石飞云制药有限公司，规格：10 mg/片，批号：20170301。用羧甲基纤维素钠配制成雷公藤多苷-CMC混悬液2.5 mg/mL。

1.4 主要实验仪器

透射电镜(荷兰ASI，型号：Chee-tah120 Timepix)，恒温箱(东莞市爱佩试验设备有限公司，型号：AP-HX)，全自动免疫组化染色机(上海精密仪器仪表有限公司，型号：MY-2300)，电泳仪(美国Bio-rad，型号：1658033)。

2 实验方法

2.1 模型复制

将II型胶原(牛)冻干粉溶解于0.1 mol/L的醋酸中，制成2 mg/mL的II型胶原(牛)醋酸溶液，备用。将大鼠腹腔注射剂量为40 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉后仰位固定于手术台。对大鼠进行右后足趾、尾根、背部3个部位皮下注射配置好的II型胶原(牛)醋酸溶液。每只大鼠3个位点共注射0.15 mL，注射10 d后，每只大鼠相同部位重复注射1次，以激发免疫反应[7]。另取10只正常对照组大鼠每次注射相同体积的生理盐水。

2.2 实验分组及给药

按照2.1项下的方法，第二次皮下注射后第3天观察大鼠后趾、尾部、耳部肿胀情况，以尾部、耳部和后趾出现炎性红肿或者结节为成功复制RA模型的标志。将RA模型复制成功的50只Wistar雄性大鼠，按照体质量区组化随机分为5组，即模型组、伸筋草高、中、低3个剂量组和阳性对照组，每组10只。

2.3 HE染色大鼠滑膜组织

在第二次皮下注射第4日起，各组大鼠开始灌胃给药。伸筋草高、中、低剂量组每日分别给药1.6 g/kg、0.8 g/kg、0.4 g/kg伸筋草提取物浓缩液(以伸筋草生药量计)；正常对照组和模型组大鼠每日分别灌胃给予等体积的生理盐水；阳性对照组每日灌胃5.4 mg/kg雷公藤多苷混悬液(以雷公藤多苷计)，连续21 d。于末次给药后次日将大鼠麻醉后，脱颈处死，取右后踝关节，钝性剥离关节滑膜组织置于-80 ℃超低温冰箱中保存。用4%的多聚甲醛固定，10%浓度的EDTA溶液进行脱钙，梯度浓度乙醇脱水后[8]，用石蜡包埋，切片后进行HE染色，光学显微镜下观察各组大鼠滑膜组织病理变化。

2.4 免疫组化方法测定滑膜组织ICAM-1、MMP-3

将大鼠踝关节滑膜组织切片后置于60 ℃的环境下1 h后，脱蜡复水。将切片用双氧水和PBS反复洗涤各3次，添加一抗37 ℃恒温1 h后，PBS反复冲洗3次，添加二抗，37 ℃温育20 min后，加入SABC，37 ℃温育30 min。漂洗后加入显色剂。蒸馏水冲洗后，光镜下观察染色结果。每张切片随机选择5个高倍视野，用Image Pro Plus系统自动定量分析阳性区域光密度值。

2.5 Western Blot方法测定滑膜组织OPG、RANKL蛋白的表达

将低温冷冻保存的各组大鼠滑膜组织粉碎后，加入细胞裂解液提取蛋白，进行SDS-PAGE电泳(蛋白上样量为50 μg)，恒流电转到PVDF膜后TBST漂洗，加入5%脱脂奶粉避光封闭2 h后漂洗3次，加入一抗(RANKL、OPG的1/1 000稀释液)4 ℃恒温过夜。漂洗3次后添加二抗(RANKL、OPG的1/5 000稀释液)，TBST漂洗3次后加入ECL，曝光后分析条带分子量及灰度值(选择GAPDH为内参蛋白)。

2.6 统计学方法

3 实验结果

3.1 伸筋草对RA大鼠踝关节滑膜组织病理的影响

HE染色实验结果见图1。正常对照组大鼠滑膜组织细胞排列整齐规则，结构完整，膜表面光滑未见增生，无炎性细胞浸润和血管充血；模型组有明显的淋巴细胞及单核细胞等炎性浸润，滑膜组织细胞排列不规则，增生肿胀明显。与模型组相比，阳性对照组和伸筋草高剂量组大鼠滑膜组织增生和炎性细胞浸润显著改善；伸筋草中、低剂量组有一定的缓解但不明显。

图1 RA大鼠踝关节滑膜组织HE染色(×400)

3.2 伸筋草对RA大鼠踝关节滑膜组织ICAM-1、MMP-3表达的影响

实验结果见表1。与正常对照组相比，模型组大鼠踝关节滑膜组织ICAM-1、MMP-3的表达均显著升高，伸筋草高、中、低剂量组均可以降低滑膜组织ICAM-1、MMP-3的水平，且呈剂量依赖性，其中高剂量伸筋草降低ICAM-1效果显著(P<0.05)，高中剂量组降低MMP-3作用明显(P<0.05)。

表1 伸筋草对RA大鼠踝关节滑膜组织ICAM-1、MMP-3表达的影响

3.3 伸筋草对RA大鼠踝关节滑膜组织OPG、RANKL蛋白表达及RANKL/OPG比值的影响

实验结果见图2、表2。

表2 伸筋草对RA大鼠踝关节滑膜组织OPG、RANKL蛋白表达及RANKL/OPG比值的影响

注：1.正常对照组；2.模型组；3.伸筋草高剂量组；4.伸筋草中剂量组；5.伸筋草低剂量组；6.阳性对照组。图2 伸筋草对OPG、RANKL蛋白表达的影响Western Blot电泳图

由实验结果可以看出，与空白对照组相比，模型组大鼠踝关节滑膜组织中OPG、RANKL蛋白表达及RANKL/OPG的比值均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，伸筋草各剂量组均可以降低OPG、RANKL表达和RANKL/OPG比值的趋势，且呈现出一定的量效关系。高剂量组作用效果最佳，中剂量组次之，低剂量组虽有降低的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。

4 讨论

RA是一种自身免疫性疾病，以关节骨损伤和慢性炎症为主要特征。主要病理改变包括滑膜组织炎性细胞的浸润、滑膜组织细胞的肿胀、充血、增生以及成纤维细胞样滑膜细胞代谢的改变[9]。我国目前的RA患者超过500万，RA严重危害我国老年人群的健康，临床急需疗效确切且安全性高的药物。

伸筋草又名舒筋草，中医用于治疗关节肿痛、风寒湿痹、筋脉拘急。多个基础研究表明伸筋草具有降低RA大鼠血清中炎性因子和镇痛的作用[8]。本研究通过对大鼠滑膜组织的病理分析可知，伸筋草具有明显的对抗RA大鼠滑膜组织增生和炎性浸润的作用。这部分研究为后续探讨伸筋草治疗RA的作用机制奠定了药效基础。

ICAM-1是黏附分子中免疫球蛋白超家族的一员，是一种含有505个氨基酸的跨膜蛋白，广泛存在于多种细胞表面。细胞膜上的ICAM-1主要与淋巴细胞功能相关抗原-1(LAF-1)相结合[10]，进而趋化血管中的白细胞向炎症发生的组织聚集，并促进多种炎性细胞的黏附，如单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞等[11]。MMP-3是研究较多的一类基质金属蛋白酶，参与了滑膜组织成纤维细胞的侵袭和致病过程。临床研究表明，MMP-3在RA患者关节组织的表达是正常患者的4倍以上[12]，因此临床上常将患者关节液中MMP-3的水平作为早期鉴别诊断RA的重要生化指标和治疗的主要疗效指标[13-14]。本研究免疫组化的结果显示伸筋草可以通过降低RA大鼠关节滑膜组织炎性因子的趋化、聚集、黏附来发挥治疗作用。

细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of the nuclear factor kappa B ligand, RANKL)，主要由成骨细胞表达，而RANK(Receptor activator of the nuclear factor kappa B)主要存在于破骨细胞的表面。RANKL与RANK结合后，会激活下游信号通路，促进破骨细胞的成熟和分化，这就使成骨细胞与破骨细胞间的平衡被打破，造成骨形成受损、骨吸收增加，进而导致关节周围骨量减少、骨侵蚀和骨损伤[15]。OPG(Osteoprotegerin)俗称骨保护素是一种分泌型糖蛋白，属于TNF受体家族成员，最早是在1997年被发现，OPG可以抑制破骨细胞的形成。OPG能够与RANKL竞争性结合，从而抑制RANKL与RANK的结合，进而抑制破骨细胞的过度分化、生成[16]。由此可以看出OPG/RANKL/RANK信号通路对成骨细胞与破骨细胞动态平衡的调控起着十分重要的作用。而RANKL/OPG的相对比值对于这个动态平衡的保持起到了关键作用[17]，这个比值能间接反映OPG/RANKL/RANK信号通路的激活程度。本研究Western Blot的结果表明伸筋草不仅可以降低滑膜组织OPG、RANKL蛋白的表达，同时还可以降低RANKL/OPG的比值，证明伸筋草可以通过调控OPG/RANKL/RANK信号通路在一定程度上恢复成骨细胞-破骨细胞的动态平衡，减少RA大鼠踝关节的损伤。

综上所述，伸筋草治疗弗氏佐剂所致大鼠RA的疗效确切，其可以降低大鼠踝关节滑膜组织炎性因子的水平，并通过调控OPG/RANKL/RANK信号通路来发挥治疗RA的作用。