铜藻主要化学成分分析及抗氧化活性评价

郑丽杰,缪晓冬,韩 威,陈 露,金佳颖,刘 睿,3,王欣之,3,吴 皓,3,*(1.南京中医药大学药学院,江苏南京 210023;2.江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室,江苏南京 210023;3.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏南京 210023;4.江苏省方剂高技术研究重点实验室,江苏南京 210023)

近年来,江苏海域频繁爆发“金潮”灾害,导致辐射沙洲紫菜养殖区域约占30%的面积受到不同程度的影响,造成紫菜筏架垮塌,紫菜机械性损伤,受灾范围波及盐城、南通紫菜企业,经济损失巨大[1-2]。经鉴定,该“金潮”灾害是由漂浮铜藻引起的。铜藻(Sargassumhorneri)是褐藻门墨角藻目马尾藻科马尾藻属的大型海藻[3]。《中国药用海洋生物》记载铜藻具有“软坚散结,消肿泄热,利水化痰”之功,它既可作为海藻工业的优质原料,又可被广泛应用于医药、食品、饲料和有机肥料等方面,具有较高的商业价值。近年来江苏沿海铜藻爆发量可达上万吨,而捕捞后的铜藻藻体却被随意堆积,造成一定的环境污染。因此,如何合理的利用爆发后的铜藻资源,使其“变废为宝”,是亟需解决的问题。

现代研究表明,铜藻中含有多糖、膳食纤维、褐藻多酚、岩藻黄质、蛋白质、脂肪酸及矿物元素等成分,其中多糖、褐藻多酚(Phlorotannin)及岩藻黄质(Fucoxanthin)等活性成分研究较为广泛。顾丽霞等[4]通过单因素与正交试验确定了铜藻粗多糖的提取工艺,并确定其抗氧化能力和免疫调节能力;许亚如[5]通过对不同褐藻中褐藻多酚含量测定和抗氧化活性比较,发现不同褐藻的抗氧化活性与褐藻多酚含量有较大关系,其中不同褐藻中以铜藻和羊栖菜中褐藻多酚含量较高,抗氧化活性较强;胡永东[6]研究了铜藻中岩藻黄质提取工艺及抗氧化活性,证明岩藻黄质具有较强的清除DPPH、超氧阴离子、以及羟基自由基的能力。

通常铜藻中多糖以水为溶剂进行提取,再经分级醇沉的方式进行纯化,邵平等[7]在对铜藻中多糖进行粗多糖含量测定及抗氧化活性研究中,将水提后的多糖醇沉分别得到30%、60%、80%醇沉多糖,以30%多糖组分对羟基自由基的清除能力最高,达98.07%,以60%多糖组分对DPPH自由基清除能力最高,达85.01%,以80%多糖组分对ABTS自由基清除能力较强,还原力较大,即不同多糖组分均具有一定的抗氧化能力。王育信等[8]以响应面优化试验得到超声提取褐藻多酚的最佳提取溶剂为55%乙醇;韩典峰等[9]以响应面试验得到超声提取岩藻黄质的最佳提取溶剂为70%乙醇,说明可以用不同乙醇对铜藻分别提取这三种活性成分。因此通过对铜藻的不同乙醇提取物的抗氧化进行研究,以确定与其相关的活性成分,为更好的开发利用铜藻提供参考依据。

基于此,本课题组对采自江苏海域“金潮”爆发期的铜藻进行多成分测定分析来评价其品质,并与不同褐藻进行比较,确定铜藻的开发优势成分,同时为开发铜藻抗氧化功能保健品提供了参考思路,以达到合理化利用废弃的铜藻资源的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铜藻及其他六种褐藻样本 见表1,均采集于3～5月份新鲜藻体,所有样本均由南京中医药大学陈建伟教授鉴定种属;葡萄糖、葡萄糖醛酸(≥99.1%) 中国食品药品检定研究院;岩藻黄质(≥95%)、2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(分析纯) 美国Sigma公司;多元素标准溶液 国家有色金属及电子材料分析测试中心;Folin-Ciocalteu试剂(分析纯) 北京索莱宝科技有限公司;硝酸65%(分析纯) 德国默克公司;氨基酸标准品 上海安谱实验科技股份有限公司;2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸)二胺盐(≥98%) 上海源叶生物科技有限公司;乙腈、正己烷、甲醇均 色谱纯,美国天地;过硫酸钾、二甲基亚砜、盐酸、硫酸等 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

表1 各样本采集信息Table 1 Collection information of samples

NexlON 350D电感耦合等离子体质谱仪 美国Perkin Elmer公司;Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2489 UV检测器 美国Waters公司;Biomate 3S型紫外可见分光光度计、BP211D型电子天平 德国Sartorious公司;SXL-1216型程控式马弗炉 国华电器有限公司;OLB9830型半自动凯氏定氮仪 济南安赛医疗器械有限公司;LA8080氨基酸自动分析仪 日本株式会社日立高新技术;Aglient 7890A/5975C气质色谱-质谱联用仪 Aglient Technologies;Major Science多功能培养箱 上海器仁仪器仪表有限公司;Multiskan GO型全波长酶标仪 Thermo Fisher scientific。

1.2 实验方法

1.2.1 样本处理 采集的样本用清水洗净泥沙,于50 ℃下烘干,打粉过40目筛网,避光存放于干燥器中。

1.2.2 营养成分测定方法 蛋白质:参照GB 5009.5-2016 《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[10];粗脂肪:参照GB 5009.168-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[11];

不溶性膳食纤维:参照GB 5009.88-2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》[12];

灰分:参照GB 5009.4-2016 《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》[13];

可溶性多糖:采用苯酚-硫酸法[14-15]与咔唑-硫酸法[16];

褐藻多酚:采用Folin-Ciocalteu比色法[17];

岩藻黄质:岩藻黄质含量测定方法参考文献[18],略有改动,并进行方法学考察,均符合2015版《中华人民共和国药典》要求。测定为:精密称取藻粉1.0 g,加入50 mL 70%乙醇,称重。在50 ℃下超声提取50 min后,取出放冷,再次称重并补足失重。取续滤液进HPLC测定峰面积。

氨基酸:参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[19];

脂肪酸:样品经索氏抽提法提取的粗脂肪经甲酯化、皂化后,由气相-质谱分析仪(GC-MS)检测[20];

微量元素:参照GB 5009.268-2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》[21]。

1.2.3 抗氧化活性研究

1.2.3.1 样品制备 取铜藻藻粉约10 g,分别使用90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇以及水为提取溶剂,以料液比为1∶15加热回流提取1 h,抽滤,并取滤液进行浓缩,再冷冻干燥得干燥粉末备用。

1.2.3.2 DPPH自由基清除实验 取DPPH适量,用甲醇配制成浓度为47.3 μg/mL的溶液,并依次稀释成23.65、11.83、5.92、2.96 μg/mL的溶液,在517 nm 波长下测定OD值。将冷冻干燥后的样品分别用10%二甲基亚砜溶液配制成系列浓度,以维生素E为对照,取一定浓度的DPPH溶液(OD值在0.6～0.8)150 μL,加入150 μL系列浓度样品溶液,终浓度为0.0156、0.0312、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000 mg/mL,分别在37 ℃孵育箱中反应30 min后测定(A0),同时以10%二甲基亚砜溶液代替样品作为对照溶液(A1),以10%二甲基亚砜溶液代替DPPH溶液作为样品空白溶液(A2),按下列公式计算不同提取物对DPPH自由基的清除率。

清除率(%)=[A1-(A0-A2)]/A1×100

1.2.3.3 ABTS自由基清除实验 将5 mL 7.4 mmol/L ABTS和88 μL 2.6 mmol/L过硫酸钾溶液混合,在室温、避光条件下静置12～16 h,形成ABTS储备液,该储备液在室温、避光的条件下表现稳定,使用前用甲醇适当稀释成工作液,使其在734 nm波长下的OD值为0.70～0.80。将冷冻干燥后的样品分别用10%二甲基亚砜溶液配制成系列浓度,以维生素E为对照,取一定浓度的ABTS溶液150 μL,加入10 μL系列浓度样品溶液,终浓度为0.00625、0.0125、0.0300、0.0600、0.0800、0.100、0.125 mg/mL,分别在37 ℃孵育箱中反应90 min后测定(A0),同时以10%二甲基亚砜溶液代替样品作为对照溶液(A1),以10%二甲基亚砜溶液代替ABTS溶液作为样品空白溶液(A2),计算不同提取物对ABTS自由基的清除率。

清除率(%)=[A1-(A0-A2)]/A1×100

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 铜藻与六种褐藻之间常规营养成分比较分析

表2为铜藻与六种常见褐藻中常规营养成分测定结果。本实验采用凯氏定氮法对不同褐藻中蛋白质含量进行测定,结果显示不同褐藻中蛋白质含量在9.54%～28.70%之间,其中以裙带菜含量最高,达28.70%,铜藻中蛋白质含量高于海带、羊栖菜、海蒿子,且有显著性差异(P<0.05)。采用索氏抽提法提取粗脂肪,结果显示不同褐藻中粗脂肪含量在0.73%～1.71%之间,铜藻中粗脂肪含量略低于海带、鼠尾藻,高于其他四种褐藻,且有显著性差异(P<0.05)。采用酶解重量法测定不溶性膳食纤维含量,除海蒿子外,铜藻与其他褐藻之间无显著性差异。采用炽灼残渣法对不同褐藻中灰分进行含量测定,结果显示不同褐藻中灰分含量范围为10.32%～20.72%,铜藻中灰分仅低于海带和裙带菜。

表2 铜藻及六种常见褐藻中常规营养成分的含量(以干重计)Table 2 Contents of nutritional components in Sargassum horneri and six Phaeophyta(measured by dry weight)

2.2 铜藻与六种褐藻中活性成分比较分析

表3铜藻与六种褐藻中三种活性成分的测定结果。其中可溶性多糖的含量范围为5.44%～16.76%,以裙带菜中最高,达16.76%,含量由大到小的顺序依次为裙带菜>海带>羊栖菜>海蒿子>鼠尾藻>铜藻>裂叶马尾藻,可见铜藻中可溶性多糖含量较低。不同褐藻中褐藻多酚含量在1.43～11.29 mg/g之间,以羊栖菜中含量最高,达11.29 mg/g,铜藻中褐藻多酚含量相对较高,含量由大到小的顺序依次为羊栖菜>铜藻>鼠尾藻>裂叶马尾藻>海蒿子>裙带菜>海带,除羊栖菜、海带外,铜藻与其他褐藻之间褐藻多酚含量无显著性差异。不同褐藻之间岩藻黄质含量范围为0.35～3.47 mg/g,其中以铜藻中岩藻黄质含量最高,达3.47 mg/g,显著高于其他六种褐藻(P<0.05)。

表3 铜藻与六种常见褐藻中活性成分的含量(以干重计)Table 3 Contents of active components in Sargassum horneri and six Phaeophyta(measured by dry weight)

2.3 氨基酸组成与分析

氨基酸作为构成蛋白质的基本物质,其含量和各种氨基酸组成比例与藻类的品质有较密切的关系。表4为铜藻与六种褐藻中氨基酸检测结果。铜藻中总氨基酸的质量分数为12.50%,低于裙带菜、裂叶马尾藻和鼠尾藻,高于海带、羊栖菜和海蒿子,但铜藻中必需氨基酸占总氨基酸的41.76%,除海带外,大于其他五种褐藻,必需氨基酸占非必需氨基酸的78.82%,符合FAO/WTO推荐的理想氨基酸模式(CEAA/CTAA)≥40%,CEAA/CNEAA≥60%),蛋白、氨基酸品质较佳。

表4 铜藻与六种褐藻氨基酸组成及含量(以干重计)Table 4 Amino acid compositions and content of in Sargassum horneri and six Phaeophyta(measured by dry weight)

2.4 脂肪酸组成与分析

采用GC-MS对脂肪酸进行分析,结果见表5。不同褐藻之间各脂肪酸相对百分含量差异较小,七种褐藻中均以C16和C18系脂肪酸为主,其中饱和脂肪酸(SFA)均以棕榈酸(C16∶0)相对含量最高,单不饱和脂肪酸(MFA)均以油酸(C18∶1)相对含量最高,多不饱和脂肪酸(PUFAs)均以花生四烯酸(C20∶4)相对含量较高。不同褐藻中,多不饱和脂肪酸相对百分比在13.19%～34.56%之间,研究表明PUFAs具有预防或降低心脑血管疾病风险的作用,营养价值较高[22],铜藻中多不饱和脂肪酸相对百分含量高于海蒿子、裙带菜,但低于其他四种褐藻。

表5 不同褐藻中脂肪酸相对百分比(以干重计,%)Table 5 Relative percentage of fatty acids in different Phaeophyta(measured by dry weight,%)

2.5 微量元素含量分析

微量元素是酶和维生素必需的活性因子,构成某些激素或参与激素的作用,并参与基因的调控和核酸的代谢以及其他特殊的生理功能等。本实验共检测了10种微量元素,包括铁、铜、锰、锌、钴、镍、钒、锡等8种人体必需微量元素。结果见表6。Zn含量以铜藻最高,为132.00 mg·kg-1,Fe含量仅低于海蒿子和裂叶马尾藻,高于其他几种褐藻。铜藻Ni、B、Mn含量最低。

表6 不同褐藻中微量元素含量(以干重计)Table 6 Contents of trace elements in different Phaeophyta(measured by dry weight)

2.6 抗氧化活性研究

2.6.1 DPPH自由基清除实验 通过将DPPH溶液适当稀释系列浓度,在517 nm下测定OD值,结果表明DPPH溶液在浓度为2.98～47.3 μg/mL呈良好的线性关系,线性回归方程为Y=0.0123X+0.0469(R2=0.9999)。故本实验选择OD值在0.6～0.8之间的浓度为47.3 μg/mL DPPH溶液为测试液。不同浓度乙醇提取物对DPPH自由基的清除结果见图1。随着各提取物浓度的增加,以90%、70%、50%乙醇提取物的DPPH自由基清除率增加缓慢,而水提取物和30%乙醇提取物的清除率升高较快,当浓度为0.5 mg/mL时,30%乙醇提取物的DPPH自由基清除率最高,清除率可达83.59%,IC50值为0.097 mg/mL。

图1 不同提取物对DPPH自由基清除活性(a)及IC50值(b)Fig.1 Scavenging activity of different extracts on DPPH(a)and IC50 values(b)

2.6.2 ABTS自由基清除实验 铜藻不同浓度乙醇提取物对ABTS+自由基清除的结果见图2。随着各提取物浓度的增加,对ABTS自由基清除率逐渐增加,但各浓度提取物中均以30%提取物的清除率最高,尤其当浓度达0.125 mg/mL时,清除率可达98.81%,其IC50值为0.027 mg/mL。

图2 不同提取物对ABTS自由基清除活性(a)及IC50值(b)Fig.2 Scavenging activity of different extracts on ABTS+·(a)and IC50 values(b)

2.6.3 不同提取物中三种活性成分含量及相关性分析 铜藻中可溶性多糖、褐藻多酚及岩藻黄质三种成分具有较好的抗氧化活性,因此对不同乙醇提取物中三种成分进行含量测定,结果见图3。结果显示水提物和30%乙醇提取物中可溶性多糖含量最高,分别为5.18%、5.19%,两者之间无显著性差异(P>0.05);50%乙醇提取物中褐藻多酚含量最高,为8.74 mg/g;与王育信等[8]以响应面优化试验确定提取褐藻多酚的最佳提取溶剂为55%乙醇结果相近;70%乙醇提取物中岩藻黄质含量最高,为0.86 mg/g,与韩典峰等[9]以响应面试验确定提取岩藻黄质的最佳提取溶剂为70%乙醇结果一致。

图3 不同提取物三种活性成分含量Fig.3 Contents of three active ingredients in different extracts注:NS表示二者之间无显著性差异;*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。

由三种成分含量与DPPH自由基清除的IC50值、ABTS自由基清除的IC50值的Spearman相关性分析可得(见表7),以可溶性多糖与DPPH自由基清除的IC50值、ABTS自由基清除的IC50值相关性最高,且呈负相关,即当可溶性多糖含量越高时,自由基清除率的IC50值越低,抗氧化活性越好,其中岩藻黄质虽有较好的抗氧化活性,但因其在铜藻内含量较低,所起作用也越低,而其是脂溶性成分,与可溶性多糖含量呈一定的负相关关系,故出现岩藻黄质与IC50值是正相关。

表7 抗氧化活性成分含量与抗氧化活性之间的相关性Table 7 Correlation between antioxidant contents and antioxidant activity

3 讨论与结论

本实验所研究的对象铜藻、裂叶马尾藻以及鼠尾藻均属于马尾藻科马尾藻属的海藻,三者之间不溶性膳食纤维、可溶性多糖和褐藻多酚等成分之间差异较小,可见同种属的海藻之间品质差异较小。因此“金潮”期爆发产生的铜藻,虽对紫菜养殖及海洋环境造成一定的危害,但其本身的利用价值依然存在。如铜藻中蛋白质含量较高且蛋白氨基酸组成模式(CEAA/CTAA)=41.76%,CEAA/CNEAA=78.85%)符合FAO/WTO推荐的理想蛋白氨基酸组成模式(CEAA/CTAA)≥40%,CEAA/CNEAA≥60%)。因此该铜藻资源可作为动物饲料添加品加以利用,以作为蛋白氨基酸的补充剂。褐藻多糖包括褐藻胶、褐藻糖胶及褐藻淀粉,其中褐藻糖胶水溶性较好[23],具有抗氧化、抗肿瘤以及提高免疫系统的作用[24-25],目前已广泛应用到保健品、化妆品等产品中[26-27]。不同褐藻之间比较,发现可溶性多糖含量以裙带菜和海带中含量较高,显著(P<0.05)高于马尾藻科的五种海藻。褐藻多酚是褐藻在生长过程中为了抵御病虫害以及各种环境压力而产生的次级代谢产物,具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、降血糖、降血脂、对神经系统具有调节作用[28-30]。七种褐藻中铜藻所含褐藻多酚含量仅低于羊栖菜,与其他几种褐藻之间无显著性差异。因此可将该铜藻资源和其他褐藻一样可作为褐藻多酚提取来源。岩藻黄质是一种类胡萝卜素的含氧衍生物,主要分布于褐藻、金藻、硅藻等藻类之中,目前多从褐藻类,如海带、马尾藻、裙带菜等中提取获得,具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗糖尿病和抗肥胖[31-34]等活性。通过测定发现,铜藻中含有较高的岩藻黄质,故将该资源作为岩藻黄质成分的提取原料,具有一定的优势。综上,铜藻虽属于生态灾害产生的资源,仍具有较大的利用价值,因此对其进行废物利用,既能解决随意堆积的环境问题,也可实现商业化应用。

铜藻中多个活性成分具有抗氧化活性,如多糖、褐藻多酚以及岩藻黄质等,本实验以不同溶剂提取铜藻,以DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力来初步考察不同提取物的抗氧化活性。在两种体系中均以30%乙醇提取物的IC50值最低,抗氧化活性较好,Spearman相关分析可知,可能与其所含的可溶性多糖含量较高有关,而水提取物中可溶性多糖虽与30%乙醇提取物中所含多糖含量无显著性差异,但其抗氧化活性却与其有显著性差异,可能的影响因素是以30%乙醇为提取液时,除多糖以外,还含有一定的褐藻多酚和岩藻黄质,对该提取物的抗氧化活性有一定的影响。故当铜藻提取液作为抗氧化活性物质使用时,可选择30%乙醇作为提取溶剂。