微酸性电解水处理对野生菌贮藏品质的影响

詹 苑,高 晴,杨 珍,叶章颖,和劲松,*(. 云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 6500;.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 30058)

云南具有独特的自然环境和绵延的绿色森林,是全国最大的野生菌产地[1]。云南省共有野生食用菌882种,占全国的90%以上,占全世界的43%以上,因此云南享有“野生食用菌王国”的美誉[2]。新鲜野生食用菌具有营养丰富、味道鲜美的特点,但其子实体水分含量高,表面组织细腻,缺乏保护结构,新陈代谢较为旺盛[3],不耐储藏,在储运过程中易出现品质劣变现象,致使鲜品在市场上的流通和供货期受到了一定的限制。因此,运用有效的野生食用菌保鲜技术,既能延长货架期以满足人们需求,又能减少营养和经济价值的损失。

研究表明,微生物侵染是造成野生菌腐烂的主要原因。生理性疾病及采后运输过程中的机械损伤易使微生物活动加快,保鲜失败,出现老化、褐变、霉烂、风味变劣等问题,导致商品价值降低,货架期缩短[4]。目前使用稀盐酸溶液、食盐溶液、苯甲酸钠等用作野生菌的防腐保鲜,但会对新鲜野生菌自身特有的风味造成一定的影响。因此,寻找出有效控制微生物的安全风险,保证野生菌风味、口感、品质的杀菌技术已成为亟待解决的问题,这对推动野生菌产业的发展具有重要意义。

目前,酸性电解水(Acidic electrolyzed water,AEW)已被用于食品清洗领域[5],微酸性电解水(Slightly acidic electrolyzed water,SAEW)是将稀盐(NaCl)溶液或稀盐酸溶液在无隔膜电解装置中进行电解,得到pH5.0～6.5、含有高质量浓度有效氯(Available chlorine concentration,ACC)和低氧化还原电位(Oxidation-reduction potential,ORP)的电解水[6]。SAEW不仅能够有效杀灭多种微生物,而且还具有瞬时、广谱、高效、安全、无残留等杀菌特点[7],且对皮肤无刺激性,于2002年6月被日本厚生劳动省认定为食品添加物[8]。因此,SAEW近年来倍受国内外关注,并在生鲜果蔬杀菌方面也有了一定的研究进展,Shoji等[9]、Maribel等[10]、Abdulsudi等[11]、胡朝晖等[12-13]、赵德锟[14-15]、刘培红等[16]、Ana等[17]、Li等[18]、Péter等[19]、向雅芳等[20]、Liao等[21]分别用微酸性电解水对鲜切卷心菜、鲜切生菜、草莓、韭菜、鲜切莲藕、红梨、火腿、米线、鲜切苹果、鲜切茄子、鲤鱼、鲈鱼片、牛肉进行了杀菌研究,结果表明SAEW具有很好的杀菌作用。当前,还没有关于SAEW处理对新鲜野生菌贮藏品质影响的研究报道。

综上,本研究将选取云南新鲜野生菌为样品,研究SAEW处理对新鲜野生菌的最佳处理工艺条件及对贮藏过程中品质变化的影响,以探讨SAEW处理在控制新鲜野生菌表面微生物侵染和贮藏品质中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

云南新鲜野生菌 购于云南农业大学附近的农贸市场,挑取新鲜、无病虫的野生菌子实体作为试验材料;草酸、三氯乙酸 成都市科龙化工试剂厂;硫代巴比妥酸 海拓国药沪试公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钾 天津恒兴试剂公司;可溶性淀粉 上海展云化工有限公司;碘化钾、抗坏血酸、碘 西陇化工试剂厂;氯化钠 天津市鼎盛鑫化工有限公司;邻苯二酚 山东西亚化学工业有限公司;硫代硫酸钠 天津科密欧化学试剂有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂 上海盛思生化科技有限公司;所有分离用有机溶剂 均为国产分析纯。

HD-240微酸性电解水生成机 上海旺旺集团;722s可见分光光度计 上海佑科精密仪器有限公司;DK-98-1恒温水浴锅 天津市莱悦纳格实验仪器有限公司;Seven-Multi型pH/电导率/离子综合测试仪 梅特勒-托利多称重设备系统有限公司;YXQ-SG41-280A高压蒸汽灭菌锅 上海析域仪器设备有限公司;AR224CN电子天平 上海海康仪器有限公司;YJ-600D超净工作台 上海中友仪器设备有限公司;BCD-206STPA冰箱 青岛海尔股份有限公司;TTL-10B超纯水机 北京同泰联科技科技有限公司;SHZ-82恒温培养箱 常州朗越仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SAEW的制备及其理化特性参数的测定 采用电解水生成机,以自来水为原水,电解浓度为9%的稀盐溶液生成SAEW。设备运行15 min,待流量稳定后采集SAEW用于试验。采用Seven-Multi型pH/电导率/离子综合测试仪对SAEW的pH和ORP进行测定,ACC采用碘量法进行测定[22]。

1.2.2 原材料处理 选取菇体完整、大小基本一致(3 cm×3 cm×5 cm)、无病虫害和机械损伤的子实体,清洗干净后放置备用。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 处理温度对处理效果的影响 将样品与不同温度(10、20、30、40 ℃)的SAEW(pH5.95,ORP为754 mV,ACC质量浓度为20.40 mg/L)按1∶10 g/mL料液比混合,每个试验做三组平行,浸泡处理5 min后取出,随后测定新鲜野生菌表面菌落总数,结果用菌落总数的死亡数量级表示。

1.2.3.2 处理时间对处理效果的影响 将样品与20 ℃的SAEW按1∶10 g/mL的料液比混合,分别处理0、3、5、7、9 min后取出,每个试验做三组平行,随后测定新鲜野生菌表面菌落总数,结果以菌落总数的死亡数量级表示。

1.2.3.3 料液比对处理效果的影响 将样品与20 ℃的SAEW分别按1∶0、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 g/mL的料液比混合,每个试验做三组平行,浸泡5 min后取出,随后进行菌落总数测定,结果以菌落死亡数量级表示。

1.2.4 SAEW处理条件优化 以单因素实验结果为基础,采用Box-Behnken模型,选取处理温度、处理时间和料液比为SAEW杀菌的主要影响因子,并以新鲜野生菌表面的菌落总数死亡数量级Y1和感官评分Y2为响应值进行SAEW优化。实验因素编码及水平可见表1。

表1 实验因素水平及编码Table 1 Coded variables levels in response surface analysis

1.2.5 感官评价 感官评定由10人组成的评定小组,对各条件下的处理效果进行评分,每个样品按色泽、气味、表面状态及霉烂菇评判,共10分,评分标准见表2。

表2 新鲜野生菌感官评分表Table 2 Sensory analysis of fresh wild fungus

1.2.6 菌落总数测定 参照GB 4789.15-2016《食品微生物学检验-霉菌和酵母菌计数》[23]。

菌落总数死亡数量级N=N0-Nt

式中:N0为初始菌落总数数量级,lg CFU/g;Nt为处理后的菌落总数数量级,lg CFU/g。

1.2.7 新鲜野生菌贮藏过程中样品品质变化 用Box-Behnken模型得出的最佳SAEW处理条件处理新鲜野生菌,将野生菌与20 ℃的SAEW按1∶15 g/mL的料液比浸泡5 min,沥干后,分装于自封袋,置于4 ℃冰箱中进行贮藏实验。定期测定样品的菌落总数、失重率、丙二醛含量、多酚氧化酶活性及维生素C含量5个指标。以蒸馏水处理进行对照实验。

1.2.7.1 失重率测定 采用重量法测定,以新鲜野生菌的初始质量与每次的测量质量之差占新鲜野生菌初始质量的百分比表示。

1.2.7.2 丙二醛含量的测定 在预冷的研钵中放入15 g样品,加6 mL 10%的三氯乙酸和少量石英砂研磨成匀浆后,再加24 mL三氯乙酸进一步研磨,将匀浆转入离心管以4000 r/min离心10 min,上清液即为样品提取液。移6 mL提取液和6 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液于具塞试管中,混匀在沸水浴上反应15 min后迅速冷却离心。取上清液测定532、600、450 nm下的吸光度,用测定的吸光值计算样品提取液中丙二醛的质量摩尔浓度[24]。

1.2.7.3 多酚氧化酶活性测定 将称取的5 g样品放在研钵中,加入适量磷酸缓冲溶液研磨成匀浆后,立即转入10 mL离心管以1000 r/min离心20 min,得到的上清液为多酚氧化酶粗提液。取上清液于420 nm下测其吸光度值的变化,多酚氧化酶活性则为此波长处的光密度变化值[25],每30 s记录1次,共读3 min。以煮过失活的酶液作为对照。

1.2.7.4 维生素C的测定 采用碘量法进行测定[26]。

1.3 数据处理

使用Design-Expert(Ver8.0.6,Statease公司)进行优化处理,Numerical程序分析预测最优值,Excel(Ver.2010,Microsoft公司)软件进行数据处理。利用SPSS进行显著性分析,显著性水平选取P=0.05。

2 结果与分析

2.1 SAEW最佳处理条件优化

2.1.1 不同因素对处理效果的影响

2.1.1.1 处理温度对处理效果的影响 由图1可见,随着处理温度的升高,新鲜野生菌表面菌落总数的死亡数量级呈先增加后平缓的变化趋势,从10 ℃的0.62 lg CFU/g增加到20 ℃的0.86 lg CFU/g,有显著差异(P<0.05),当温度在20～30 ℃之间时菌落总数死亡数量级出现减少现象,但当温度高于30 ℃后死亡数量级又开始增加,此结果与于晓霞[27]关于酸性电解水对鲜切果蔬的杀菌效果的研究结果一致,可能是高温使微生物部分失活,从而出现菌落总数死亡数量级有所增加。经显著性分析,当温度达20 ℃后,SAEW处理对新鲜野生菌表面微生物的杀菌效果不显著(P>0.05)。同时考虑到高温热杀菌会损坏到新鲜野生菌本身的感官品质,因而可选择的最佳杀菌温度为20 ℃。

图1 不同处理温度对菌落总数死亡数量级的影响Fig.1 Effects of different temperature treatment on the number of dead colonies注:不同小写字母表示显著性差异(P<0.05);图2～图3同。

2.1.1.2 处理时间对处理效果的影响 由图2可见,在杀菌时间5 min内,新鲜野生菌表面菌落总数死亡数量级增加明显,从3 min的0.26 lg CFU/g增加到5 min的0.49 lg CFU/g。随着杀菌时间的延长,时间达5 min后,菌落总数死亡数量级趋于稳定(P>0.05),因为随着处理时间的增加,SAEW的ACC及ORP逐渐减少,而pH逐渐上升,杀菌效果逐渐降低[27],因此选择最佳浸泡时间为5 min。

图2 不同处理时间对菌落总数死亡数量级的影响Fig.2 Effects of different time on the number of dead colonies

2.1.1.3 料液比对处理效果的影响 由图3可见,新鲜野生菌表面菌落总数的死亡数量级随料液比的增加呈增加趋势,从1∶5 g/mL的0.31 lg CFU/g增加到1∶15 g/mL的0.45 lg CFU/g,经显著性分析可知,当料液比达到1∶15 g/mL后,菌落总数死亡数量级增加趋缓,无显著差异性(P>0.05),这可能是野生菌与微酸性电解水的接触面积有限,从而一定程度上限制了SAEW的杀菌效果。因此选择SAEW与新鲜野生菌的最佳处理料液比为1∶15 g/mL。

图3 不同料液比对菌落总数死亡数量级的影响Fig.3 Effect of different feed-liquid ratio on the number of dead colonies

2.1.2 回归方程的建立

2.1.2.1 建立回归方程 为保证SAEW处理在有效控制新鲜野生菌表面菌落总数的同时,不损坏野生菌的感官品质,在单因素实验结果分析的基础上,使用Design-Expert 8.0.6软件,进行优化设计,设计方案与结果如表3所示。

表3 实验设计与结果Table 3 The experimental design and results

通过对表3中的试验数据进行多元回归拟合,分别获得菌落总数死亡数量级Y1和感官评分Y2对各变量处理时间A、处理温度B、料液比的二次多元回归方程为:

Y1=1.19+0.35A+0.048B+0.086C+0.11AB+0.070AC+2.500×103BC-0.21A2-0.071B2-0.12C2

式(1)

Y2=8.94-0.36A-0.14B+0.10C+0.013AB-0.023AC-0.015BC-0.78A2-0.29B2-0.12C2

式(2)

2.1.2.2 回归模型分析 为验证回归方程的可靠性,对方程进行方差分析,结果见表4。

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)for regression equation

综上所得,3个变量(处理时间A、处理温度B、料液比C)与两个响应值(菌落总数死亡数量级Y1和感官评分Y2)之间的关系可行,因此可用该模型进行试验结果分析。

2.1.2.3 主效顺序分析 为分析不同影响变量对处理效果的主效顺序,对模型中回归系数进行了显著性检验。由表5可知,对于响应值(菌落总数死亡数量级Y1),一次项A(处理温度)(P<0.0001)影响极显著,C(料液比)(P<0.05)影响显著;二次项A2(P<0.01)影响极显著,C2(P<0.05)影响显著;交互项AB(P<0.05)影响显著;对于响应值感官评分Y2,一次项A、B、C影响极显著(P<0.0001);二次项A2、B2、C2影响极显著(P<0.0001)。综上可知,各变量对响应值Y1(菌落总数死亡数量级),影响因子的主效顺序为A>C>B；对响应值Y2(感官评分)，影响因子的主效顺序为A>B>C。

表5 回归方程系数显著性检验Table 5 Significance test for regression coefficients

2.1.3 响应面交互作用分析 响应曲面的倾斜度反应的是响应值对各因素变化的敏感度,由图4a可以看出响应值(菌落总数死亡数量级)随着温度或时间的增大在逐渐增大,响应曲面具有一定倾斜度,说明菌落总数死亡数量级会受到温度和时间的影响。由图4b可以看出,温度对菌落总数死完数量级具有很强的敏感性,随着处理温度的增加,响应值缓慢增加。由图4c可以看出,随处理时间和料液比的增加,响应值变化较小,说明处理时间和料液比对响应值(菌落总数死亡数量级)的敏感性小。

图4 SAEW杀灭新鲜野生菌表面菌落总数的响应曲面Fig.4 The response surface of SAEW to destroy the total surface colony of fresh wild bacteria

由图5a可以看出,随着处理温度和处理时间的增加,新鲜野生菌感官评分呈先增大后减小的变化;由图5b可以看出,随着料液比和温度的增加,感官评分呈先增大后减小的变化,且处理温度对响应值的影响明显大于料液比;由图5c可看出,随着料液比和处理时间的增加,响应值(感官评分)呈缓慢增加。

图5 SAEW杀灭新鲜野生菌感官评分的响应曲面Fig.5 SAEW response surface to the sensory evaluation of fresh wild bacteria

2.1.4 最佳处理条件确定与验证 为确保SAEW具有较好杀菌效果的同时,不损坏新鲜野生菌自身品质,进一步确定SAEW的最优处理条件,以菌落总数死亡数量级Y1和感官评分Y2为响应值,采用Numerical分析,以相应实验数据为基础,综合优化得到的最佳处理温度为21.40 ℃、最佳处理时间为4.94 min、最佳料液比为1∶16.98 g/mL。为了便于实验操作,将各因素条件调整为:最优处理温度为20 ℃、最优处理时间为5 min、料液比为1∶15 g/mL。

为验证优化条件的可行性,按优化条件对新鲜野生菌进行了处理,以菌落总数死亡数量级和感官评分为检验指标进行了3组试验,结果如表6。

表6 经回归模型优化后的杀菌结果及验证Table 6 Validity verification of the developed regression melod

由表6可知,野生菌的表面菌落总数死亡数量级实测值为1.22±0.06,感官评分实测值为8.86±0.08,与预测值基本相符,证明模型优化条件具有可行性。

2.2 新鲜野生菌样品在贮藏过程中的品质变化

2.2.1 SAEW处理对新鲜野生菌表面微生物的影响 新鲜野生菌组织柔嫩、营养物质丰富,易受微生物侵染,而滋生微生物会影响野生菌自身品质。因此,在贮藏试验中首先就SAEW处理对新鲜野生菌表面菌落总数的影响进行了研究。

由图6可知,从第0 d到第8 d,SAEW处理组和蒸馏水处理组野生菌样品表面的菌落总数分别从0.85、1.18 lg CFU/g增加至1.72和1.82 lg CFU/g。在贮藏试验中,SAEW处理组与蒸馏水处理组的新鲜野生菌表面的菌落总数均随时间的增加而增加,同时可看出在相同的贮藏温度和时间下，SAEW处理组样品表面的菌落总数明显低于蒸馏水处理的对照组样品,此结果与盛孝维[28]关于酸性电解水对鲜切香菜表面微生物影响的研究结果一致。综上表明,SAEW处理有较好的杀菌效果,且处理后的野生菌样品中微生物生长受到限制。

图6 SAEW处理对野生菌表面菌落总数的影响Fig.6 Effect of SAEW treatment on the total number of colonies on the surface of fresh wild fungi

2.2.2 SAEW处理对新鲜野生菌丙二醛含量的影响 丙二醛含量是衡量细胞膜透性和稳定性的重要指标,丙二醛可以损坏野生菌的生物膜,使膜蛋白发生聚合,同时降低膜脂的不饱和度而引起膜流动性降低,造成细胞膜系统损坏,加速野生菌衰老[29]。丙二醛还与野生菌褐变有关,因此,在贮藏试验中就SAEW处理对新鲜野生菌丙二醛含量的影响进行了研究。

如图7所示,随贮藏时间的增加,SAEW处理组与蒸馏水处理对照组的丙二醛含量均呈上升趋势,表明随着贮藏时间延长野生菌老化度及褐变度均会增加。在12 d的贮藏时间内,对照组的丙二醛含量从最初的0.53 μmol/L增加到2.22 μmol/L,而由SAEW处理的野生菌在贮藏末期丙二醛含量为1.78 μmol/L,两种处理方式对丙二醛含量的影响具有显著差异(P<0.05)。以上结果表明,SAEW处理对丙二醛含量的增加具有延缓作用,一定程度上减轻了新鲜野生菌的褐变。

图7 SAEW处理对新鲜野生菌中丙二醛含量变化的影响Fig.7 Effect of SAEW treatment on the change of malondialdehyde content of fresh wild bacteria

2.2.3 SAEW处理对新鲜野生菌重量变化的影响 新鲜野生菌采后失水是一种很常见的现象,同时也是造成失重的主要原因。充足的水分是保证野生菌子实体外观品质的重要因素,水分损失太多,会出现萎蔫,失去新鲜度,最终散失食用价值。

由图8可见,SAEW处理与蒸馏水处理对照组的失重率(%)均随时间的延长而增加,在处理第2 d后,重量损失速度迅速加快。SAEW和蒸馏水两种处理方式对比发现,在12 d的贮藏期内,两种处理对新鲜野生菌失重率的影响无显著差异(P>0.05),而且SAEW处理组的失重率低于对照组,贮藏至第12 d时,SAEW处理与蒸馏水处理的失重率(%)分别为1.27%和1.34%。以上结果表明,SAEW处理对新鲜野生菌的质量损失具有一定缓解作用。

图8 SAEW处理对新鲜野生菌失重率变化的影响Fig.8 Effect of SAEW treatment on the change of weightlessness rate of fresh wild bacteria

2.2.4 SAEW处理对新鲜野生菌中维生素C含量的影响 野生菌中含有多种维生素,而维生素C就是其中之一,它易随温度、时间的变化而减少,从而对鲜野生菌的营养品质造成影响。

由图9可见,新鲜野生菌样品中维生素C的含量随时间的延长呈先上升后降低的趋势,贮藏第2 d测得维生素C含量最大值。贮藏第12 d时,SAEW处理组与蒸馏水处理的对照组中维生素C含量分别为1.55和0.80 mg/100 g,两种处理方式对维生素C含量的影响有显著差异(P<0.05)。王丹等[30]也研究了不同清洗剂处理对鲜切菠菜中维生素C含量的影响,发现当储藏时间到达第10 d时,弱酸性电解水处理的鲜切菠菜维生素C含量显著高于无菌水处理的样品,与本研究结果基本一致。在本研究中,SAEW处理导致新鲜野生菌中维生素C含量降低,可能是由于SAEW处理能够抑制其中部分酶的活性所致。表明SAEW处理能够延缓新鲜野生菌中维生素C含量的衰减。

图9 SAEW处理对新鲜野生菌VC含量变化的影响Fig.9 Effect of SAEW treatment on vitamin C content of fresh wild bacteria

2.2.5 SAEW处理对新鲜野生菌多酚氧化酶活性的影响 多酚氧化酶可将酚类物质催化为褐色的醌,在525 nm处测得最大吸光值。多酚氧化酶随着活性的升高,具有阻止外界微生物侵染,保护正常组织完成生理功能的作用,同时在表现形式上成为褐变的重要标志[31]。目前国内外很多研究报告指出:果蔬褐变成度与多酚氧化酶活性成正相关,果蔬的褐变常伴随多酚氧化酶活性的提高。

由图10可见,多酚氧化酶活性随时间的延长,呈先上升后下降的趋势变化,SAEW处理组样品的多酚氧化酶活性明显低于蒸馏水处理的对照组样品,在第6 d时达到最大值,之后缓慢衰减。因此,SAEW处理有助于降低多酚氧化酶活性,从而减轻由多酚氧化酶引起的新鲜野生菌褐变。

图10 SAEW处理对新鲜野生菌中多酚氧化酶活性变化的影响Fig.10 Effect of SAEW treatment on changes of polyphenol oxidase activity of fresh wild bacteria

3 结论

试验结果表明,在单因素试验结果的基础上运用响应面法(RSM)对SAEW处理条件进行进一步优化,得到最佳处理条件为:处理时间5 min、处理温度20 ℃、料液比1∶15 mL/g。在此条件下,SAEW处理对新鲜野生菌表面菌落总数具有较好的杀菌效果,同时,用SAEW对新鲜野生菌进行贮藏前处理,可有效地抑制多酚氧化酶活性和丙二醛含量的增加,延缓维生素C的衰减速度,而对失重率无显著影响。由此得出,SAEW处理可有效地控制微生物的污染,还能延缓营养成分的衰减,达到延长其货架期的目的,为新鲜野生菌贮藏保鲜研究提供理论依据。