蒙古扁桃种仁不同极性部位对博来霉素致大鼠肺纤维化的保护作用

权博文,吴 桐,刘 庆,高 晨,周红兵,白迎春,*,石松利,*(.内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古包头 04040;2.内蒙古扎兰屯职业学院,内蒙古扎兰屯 62650;3.包钢集团第三职工医院,内蒙古包头 04040)

肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是一组以肺间质弥漫性渗出浸润和纤维化为主要病变的疾病,对人体危害极大,其发病初期无明显病症,但随着病情发展会出现咳嗽、胸闷并产生呼吸不畅、气喘等现象。临床上称其为间接性呼吸困难[1]。近些年来,肺纤维化的发病率越来越高,但是临床上仍然缺乏较有效的治疗手段和针对性药物,而氧化应激和过度炎症反应在其发生发展中起重要作用[2]。在寻找对肺纤维化有效的治疗药物中,中药在治疗肺纤维化中,效果明显,毒副作用小[3-5],近年来中医药防治肺纤维化已成为肺科学界关注的重点[6-7],中医对该病的认识与研究日趋成熟,发现了很多在临床和实验中对预防和治疗肺纤维化有效的药物[8-9]。

蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)蒙名乌兰布依勒斯,又名山樱桃、土豆子等,是蔷薇科扁桃属的多年生木本植物,是北方重要的木本油料树种之一[10-11],旱生落叶灌木,为蒙古高原特有的阿拉善荒漠种[12],属于国家二级保护植物[13]。其种仁可代中药郁李仁入药,具有治疗咽喉干燥、干咳及支气管炎、阴虚便秘等功效[14]。蒙古扁桃种仁中含油脂类、不饱和脂肪酸等[15],以及一定的多糖、黄酮类和酚类化合物[11，16-17],具有抗氧化应激等作用[18]。为此本实验对蒙古扁桃治疗肺纤维化的作用机制进行探究。

本研究采用博莱霉素气管内注射建立SD大鼠肺纤维化模型,观察蒙古扁桃对肺纤维化大鼠肺组织病理学改变、氧化应激和炎症介质的影响,探索蒙古扁桃对肺纤维化大鼠的保护作用及其相关机制,从而为其临床应用于肺纤维化的防治提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

70只健康雄性SD大鼠 7～8周,体重(120±20) g,北大医学部(实验动物科学学院)，许可证号 SCXK(京)2017-0005;蒙古扁桃种仁 内蒙古西北部及周边省市;盐酸博来霉素(批号:540402) 日本化药株式会社;醋酸泼尼松片(强的松)(批号:160905) 浙江仙琚制药股份有限公司;总蛋白定量测定试剂盒(批号:20170619)、MDA试剂盒(批号:20170625)、SOD试剂盒(批号:20170605) 南京建成生物工程研究所;mRNA提取试剂TRIzol Thermo Fisher Scientific公司;逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific公司;qPCR试剂RealSYBR Mixture 康为世纪公司;PCR引物 宁夏科诺嘉华生物工程有限公司。

RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;全自动脱帽离心机 长沙鑫奥仪器;LEICA-TP1020生物组织自动脱水机、RM2235切片机、LEICA-EG1150C生物组织包埋机 德国徕卡公司;CX32显微镜 日本奥林巴斯公司;Tip头、EP管、NanoDrop 2000微量分光光度计、Vlultifuge X1R高速冷冻离心机 美国赛默飞公司;7500型Real-time PCR仪 美国AB公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蒙古扁桃种仁不同极性部位的制备 取蒙古扁桃种仁,去外壳,研磨成粉末状,用75%乙醇回流提取制备总提取物(2 h,70 ℃),料液比1∶10 g/mL。得到总提取物后用液液萃取的方法用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水,按 1∶2体积比萃取,每种溶剂萃取3次,分别减压浓缩回收各溶剂得到各个部位溶剂提取物[19],蒸干以去除残留试剂,各部位提取物得率分别为:石油醚部位56.68%、乙酸乙酯部位8.38%、正丁醇部位23.35%、水部位11.59%。

1.2.2 动物分组与给药 根据正常成人所需的蒙古扁桃药材种仁每天的最大用药量9.0 g计算[20],考虑中药药效可能为不同成分联合作用,将给药剂量加大,蒙古扁桃药材石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物均按照生药量1.5 g/kg给药。使用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液作为溶剂配制成蒙古扁桃药材不同极性提取物药液,4 ℃冰箱保存。70只SD大鼠饲养一周,按体重随机分为7组,分别为假手术组、模型组、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水、阳性药强的松组(1.5 g/kg)。

大鼠肺纤维化的造模方法参考文献[21-22]。用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,将大鼠仰卧放置,用绳子固定四肢,再固定大鼠口腔,将舌头拉出,压住舌腹,在额镜下观察,趁大鼠吸气时,迅速将气管插管。模型组(BLM组)和给药组按5 mL/kg缓慢注入1 mg/mL博来霉素,假手术组按5 mL/kg缓慢注入生理盐水,注射完成后立即摇晃旋转大鼠,使药液在肺内均匀分散。

各组于造模24 h后灌胃给药,每日1次,连续4周。造模同时给药,蒙古扁桃药材石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物均按照生药量1.5 g/kg给药,按大鼠体重5 mL/kg灌胃给药,模型组和假手术组按大鼠体重5 mL/kg灌胃生理盐水,每天给药1次,观察大鼠活动情况及有无死亡现象,饮水、进食等。温度为22～26 ℃,湿度为35%～50%。

1.2.3 标本采集 在实验的第4周末次给药。24 h后,称量体重,腹腔注射10%水合氯醛,麻醉后,仰卧并固定,切开腹腔,腹主动脉取血,摘取肺、进行称重,并计算肺系数,肺系数(%)=肺湿重×100/体质量。从左肺叶中部切取0.7 cm×0.5 cm×0.3 cm大小肺组织做HE、Masson染色;右肺制成10%肺组织匀浆,离心后取上清液,按试剂盒要求检测肺组织匀浆中SOD活性及MDA的含量;所采血液置于4 ℃下,6000 r/min冷冻离心10 min,分离血清,检测血清SOD、和MDA含量。

1.2.4 相关细胞因子mRNA表达 Real-time PCR法检测 TGF-β1、Smad3和α-SMA mRNA表达。取肺组织80 mg,研磨并加入加1 mL TRIzol,研磨至组织与TRIzol充分溶解,提取上层RNA溶解物后测浓度。取总RNA 2 μg进行逆转录,反应条件为37 ℃反转15 min,85 ℃ 5 s,合成cDNA。PCR引物序列如表1,PCR扩增反应条件为95 ℃预变性10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃退火延伸45 s后采集信号,重复40个循环。每个组别做3次定量检测,并计算mRNA的相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 数据处理

实验结果由荧光定量分析软件进行统计和计算,并生成相应的Excel原始数据文件。根据原始检测结果,按照相对定量计算公式2-ΔΔCt计算相应实验结果。

2 结果与分析

2.1 蒙古扁桃药材不同极性部位对肺系数的影响

表2结果显示,与假手术组对比,模型组大鼠的肺系数极显著升高(P<0.01);与模型组对比,蒙古扁桃药材石油醚部位组、正丁醇部位组、水部位组均能显著降低大鼠的肺指数(P<0.05),说明蒙古扁桃药材石油醚部位、正丁醇部位水部位对肺水肿程度有明显改善。

表2 蒙古扁桃药材不同极性部位对大鼠肺系数的影响Table 2 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on lung coefficient coefficient of rats

2.2 蒙古扁桃药材不同极性部位对肺纤维化大鼠肺病理组织学的影响

HE染色镜下观察所见:空白组大鼠肺组织内部结构清晰,肺泡间隔未见增厚;模型组大鼠肺组织肺泡间隔明显增厚,肺泡结构消失,有纤维灶形成;蒙古扁桃石油醚和正丁醇剂量组与强的松组肺泡结构清晰,肺纤维化程度较模型组明显减轻。HE病理切片见图1。

图1 蒙古扁桃药材不同极性部位对肺纤维化大鼠肺病理组织学的影响(HE染色,×100)Fig.1 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on lung histopathology of rats pulmonary fibrosis(HE staining,×100)注:A:假手术组;B:模型组;C:蒙古扁桃石油醚部位提取物组;D:蒙古扁桃乙酸乙部位提取物组;E:蒙古扁桃正丁醇部位提取物组;F:蒙古扁桃水部位提取物组;G:强的松组；图2同。

Masson染色镜下观察所见:假手术组为正常肺组织结构,仅小部分肺泡周围或支气管壁轻微增厚;模型组肺组织可见全视野纤维化改变;蒙古扁桃石油醚部位组和正丁醇部位组肺泡或支气管壁中度增厚,部分肺泡结构遭到破坏,有纤维灶形成,肺纤维化程度较模型组明显减轻,Masson病理切片见图2。

图2 蒙古扁桃药材不同极性部位对肺纤维化大鼠肺病理组织学的影响(Masoon染色,×100)Fig.2 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on lung histopathology of rats pulmonary fibrosis(Masson staining,×100)

2.3 蒙古扁桃药材不同极性部位对血清、肺脏组织匀浆MDA、SOD的影响

表3、表4结果表明,与假手术组对比,模型组大鼠血清和肺组织中SOD含量极显著下降,MDA含量极显著增高(P<0.01);与模型组对比,蒙古扁桃药材石油醚部位组和正丁醇部位组和强的松组能提高肺组织和血清SOD含量,蒙古扁桃药材石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇组和强的松能降低血清与组织中MDA,存在显著或极显著差异,说明蒙古扁桃药材石油醚部位和乙酸乙酯部位和正丁醇部位能够减轻博来霉素诱导的氧化应激损伤,从而减轻肺纤维化。

表3 蒙古扁桃药材不同极性部位对血清及肺组织中SOD的影响Table 3 Effects of different polar extracts of Amygdalusmongolica on serum SOD in rats with pulmonary fibrosis

表4 蒙古扁桃药材不同极性部位对血清及肺组织中MDA的影响Table 4 Effects of different polar extracts of Amygdalusmongolica on serum MDA in rats with pulmonary fibrosis

2.4 蒙古扁桃药材不同极性部位对肺纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号传导通路的影响

表5结果显示,与假手术组相比,模型组肺组织TGF-β1、Smad3和α-SMA mRNA极显著增高(P<0.01);与模型组相比,蒙古扁桃石油醚部位组TGF-β1极显著降低(P<0.01),强的松组TGF-β1显著降低(P<0.05),蒙古扁桃石油醚部位组和正丁醇部位组Smad3显著降低(P<0.05),蒙古扁桃正丁醇部位组和强的松组α-SMA显著降低(P<0.05)。表明蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位能够抑制肺组织氧化应激以及细胞外基质的产生与沉积。

表5 蒙古扁桃不同极性部位对肺纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号传导通路的影响Table 5 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on TGF-β1/Smad of signaling pathway in rats with pulmonary fibrosis

3 讨论与结论

气管内注射博来霉素诱导大鼠肺纤维化,其方法与人类特发性肺间质纤维化极其相似,有较高的参考价值,广泛应用于科学研究工作中[23-24]。博来霉素是目前世界公认的致肺纤维化药物,实验证明其会导致大鼠肺组织结构破坏、肺泡间隔增大、大量的炎细胞浸润及成纤维细胞明显增殖,同时TGF-β1/α-SMA表达明显增高[25-26]。本实验通过气管内注射博来霉素复制肺纤维化模型,结果通过Masson、HE、PCR实验均验证出模型组较空白组TGF-β1及α-SMA表达明显高并具有显著性差异,表明本实验造模成功。

肺指数是反映肺组织炎症和肺纤维化程度的指标之一。本研究结果显示蒙古扁桃各组大鼠肺指数较模型组降低,表明蒙古扁桃可以修复肺组织损伤,最终逆转大鼠肺纤维化。

氧化应激是指机体内自由基产生过多,超出了机体的清除能力,导致氧化/抗氧化失衡的一种状态。氧化应激在肺纤维化发生发展中的重要作用已得到了人们的共识[27]。MDA是脂质过氧化反应时产生的代谢产物,其含量可反映机体内脂质过氧化的程度。SOD是内源性抗氧化酶,可清除自由基,保护细胞免受自由基的损伤,其活力的高低可反映机体清除氧自由基的能力。本研究结果显示模型组肺组织SOD活性显著降低,MDA含量显著升高,表明大鼠体内氧化系统与抗氧化系统失衡,肺纤维化大鼠体内的活性氧(如羟自由基、过氧化氢等)致使肺泡上皮细胞和血管内皮细胞受损,从而导致大鼠肺组织损伤[28]。

TGF-β1是重要的致纤维化因子之一,通过促进下游纤维化相关靶基因过量表达,引起组织瘢痕，现已证实TGF-β1在体内发挥促纤维化作用,其作用已得到肯定[21]。α-SMA是SMA中最主要的肌动蛋白微丝,是成肌纤维细胞(MF)的表型标志,MF是细胞外基质(ECM)的主要来源,而ECM沉积增多是组织纤维化的特征。α-SMA作为平滑肌的特征性标记物,是成纤维细胞收缩表型的典型标志,可以反映平滑肌数量及收缩能力的改变,是平滑肌细胞收缩的结构基础,它具有收缩能力及较强胶原合成能力,促进I型胶原的沉积,进而形成纤维化。α-SMA的表达与细胞的增殖呈正相关[29]。本研究显示,PF模型大鼠肺泡结构紊乱,肺泡壁破坏,肺泡腔及间质内有炎症细胞渗出,肺泡隔明显增厚,可见大量胶原纤维增生、沉积蒙古扁桃治疗后,大鼠肺部的炎症明显减轻,肺泡结构较整,间质胶原沉积减少,表明本方能够改善PF异常的组织病理形态表现。通过观察TGF-β1及其信号转导通路的Smad2、Smad3、Smad7表达水平,说明蒙古扁桃可从mRNA和蛋白水平抑制TGF-β1、Smad3的表达,改善PF作用可能与调节TGF-β1/Smads信号通路有关。

综上所述,蒙古扁桃可抑制肺纤维化的发生发展,其机制可能与增强抗氧化能力以及减轻炎症反应有关,在博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中,TGF-β/Smad通路可上调相关基因表达,说明活化这条通路可能导致纤维化发生。TGFβ1的激活可使成纤维细胞中胶原过度分泌,影响肺纤维化形成进而上调基质和其它结缔组织大分子的表达促进纤维化进程。此外,TGF-β通路还可能通过激活EMT(上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition)的发生,导致肌成纤维细胞大量产生,达到促肺纤维化作用。这些作用机制的揭示为指导蒙古扁桃的开发及临床用药提供了可靠的药理学依据。目前关于这条通路在肺纤维化中作用及相互间关系的研究还处于初步阶段,其具体机制有待进一步确认及深入研究。