褐藻胶裂解酶的研究进展

罗丹丹，薛永常

(大连工业大学 生物工程学院，大连 116034)



褐藻胶裂解酶的研究进展

罗丹丹，薛永常

(大连工业大学 生物工程学院，大连 116034)

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向异构体α-L-古洛糖醛酸结合而成的线性高分子多糖。褐藻胶裂解酶通过β消去机制能将褐藻胶降解成具有生物活性的褐藻寡糖。褐藻寡糖因具有独特的促进生长、增强植物抗性、抑菌等生理活性而日益受到人们的关注。简要概述了褐藻胶裂解酶的来源分类、结构功能、酶学性质、褐藻寡糖的应用等方面的研究进展，为褐藻胶裂解酶在工业生产的应用提供理论依据。

褐藻胶;褐藻胶裂解酶;褐藻寡糖

褐藻胶是存在于褐藻细胞壁及细胞间质的水溶性酸性多糖，由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向异构体 α-L-古洛糖醛酸两种糖醛酸单体通过1,4糖苷键随机聚合而成[1]。褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物，近年来关于其研究日益增多，研究发现聚合度为3～6的褐藻寡糖具有较好的促进植物根系生长的活性；聚合度为6.8的褐藻寡糖具有较高的激发子活性；聚合度为5～23的褐藻寡糖具有较好的抑菌活性；除此之外，还发现褐藻寡糖具有增强宿主免疫系统，提高生物体对肿瘤抗性及抗凝血的能力[2]。褐藻寡糖在促进生长、增强植物抗性、抗肿瘤等方面所具有的生理活性使其在农业、医药、饲料等领域具有广阔的应用前景。用酶法降解褐藻胶取代传统的物理法、化学法生产褐藻寡糖已成趋势，褐藻胶裂解酶作为降解褐藻胶的工具酶，对其研究对于褐藻寡糖的综合利用具有重要的实际意义。本文从褐藻胶裂解酶的来源分类、酶学性质、结构功能、褐藻胶裂解酶及褐藻寡糖的应用等方面概述了近年来国内外褐藻胶裂解酶的研究进展。

1 褐藻胶裂解酶的来源、分类

1.1 褐藻胶裂解酶的来源

褐藻胶裂解酶主要来源海洋藻类、软体动物、棘皮动物和多种微生物。目前发现的褐藻胶裂解酶大部分来源于细菌，如固氮菌Azotobactervinelandii、棒杆菌Corynebacteriumsp.ALY-1、交替假单胞菌Pseudoaltermonaselyakovii等[3]。在皱纹盘鲍、纽西兰鲍螺等海洋软体动物的肝胰腺及小球藻病毒中也有褐藻胶裂解酶发现。相较于来源微生物的褐藻胶裂解酶研究的较多，而来源于海洋动物的褐藻胶裂解酶的研究较少。

1.2 褐藻胶裂解酶的分类

根据褐藻胶裂解酶作用方式的不同，可分为内切酶与外切酶，目前发现的褐藻胶裂解酶大多数具有内切酶活性，外切酶较少见[1]。

根据褐藻胶裂解酶降解底物专一性不同可将褐藻胶裂解酶分为3类：专一性裂解多聚甘露糖醛酸(poly M)的裂解酶；专一性裂解多聚古洛糖醛酸(poly G)的裂解酶；两种多聚糖都可裂解的双功能裂解酶[3]。褐藻胶裂解酶的作用方式及作用位点见图1。

图1 褐藻胶裂解酶酶切位点及作用方式示意图

注：空心箭头显示处为外切褐藻胶裂解酶作用位点，实心箭头显示处分别为内切褐藻胶裂解酶降解poly M、poly MG、poly G作用位点

根据其相对分子质量的不同可将褐藻胶裂解酶大致分为3类：第1类分子量在 20 ku～35 ku之间；第2类分子量约为40 ku；第3类分子量约为60 ku[1]。

在多糖裂解酶家族中，根据酶的氨基酸序列相似性，褐藻胶裂解酶被划分在PL5、PL7、PL14、PL15等多糖裂解酶家族中。大多数褐藻胶裂解酶属于PL5和PL7家族[1]。

2 褐藻胶裂解酶的酶学性质

大部分褐藻胶裂解酶的最适pH值是中性或偏弱碱性，少数为酸性；最适温度一般处于30℃～50℃之间，褐藻胶裂解酶的来源不同，酶学性质也有一定的差异。如来自交替假单胞菌的Pseudoalteromonassp.CY24[4]的褐藻胶裂解酶的最适 pH值为10.6，海洋细菌StenotrophomasmaltophiliaKJ-2[5]重组褐藻胶裂解酶最适pH值为9.0，在pH 8.5～10.0范围内稳定。海洋细菌Pseudomonassp.E03[6]的褐藻胶裂解酶pH值稳定范围为6.0～9.0。但是海洋弧菌QY103[7]所产褐藻胶裂解酶在pH 6.0时活性最强，在pH 5.0～9.0之间活性比较稳定。褐藻胶裂解酶ALGL[8]的最适pH也是偏酸性为6.6，不过ALGL的酸碱稳定性较差，仅能在pH 6.5～7.0环境中维持稳定2 h。QY103产褐藻胶裂解酶及褐藻胶裂解酶ALGL与早期发现的Azotobactervinelandii[9]产的褐藻胶裂解酶性质有些相似，它们的最适pH都是偏酸性的，Azotobactervinelandii产的褐藻胶裂解酶的最适pH值为4.2。大部分褐藻胶裂解酶的最适温度处于30℃～50℃之间，只有少部分褐藻胶裂解酶的最适温度会高于50℃，大多数的褐藻胶裂解酶的温度稳定性都较差，不利于高温下酶促反应的进行。本实验室最近也筛选一株产褐藻胶裂解酶的海洋细菌，其最适pH 5.0，pH值在4～8之间酶活稳定，最适温度处于40℃～50℃之间。

褐藻胶裂解酶活性受金属离子影响。由于褐藻胶裂解酶的产生菌多是从海洋中筛选，所以Na+对酶活有一定的影响。如Vibriosp.QY105[10]所产褐藻胶裂解酶对Na+有很强的依赖性，在没有Na+的反应体系中几乎检测不到酶活。多数情况下Na+、K+、Ca2+、Mg2+等离子对酶活有促进作用，而SDS、EDTA、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+等对酶活有抑制作用。少数情况下EDTA对酶活有促进作用，如EDTA对海洋细菌Vibriosp.QY103[7]及链霉菌Streptomycessp.A5[11]所产褐藻胶裂解酶酶活均有促进作用。Zn2+对Vibriosp.W13[12]产褐藻胶裂解酶酶活有抑制作用，而对Pseudomonassp.E03[6]产褐藻胶裂解酶酶活却有促进作用。

褐藻胶裂解酶能够将褐藻胶降解为聚合度20以下的褐藻寡糖。海洋细菌StenotrophomasmaltophiliaKJ-2[5]产褐藻胶裂解酶降解产物为褐藻二糖、三糖、四糖；细菌Flavobacteriumsp.S20[13]产褐藻胶裂解酶降解产物为褐藻五糖、六糖、七糖，重组酶Alg7D[14]的降解产物主要为褐藻四糖、五糖及少量的二糖和三糖，是多种低聚寡糖的混合物。而海洋弧菌Vibriosp.QY107[15]产褐藻胶裂解酶的降解产物主要为褐藻三糖，只有极少量的二糖生成，降解产物比较单一，这在已发现的褐藻胶裂解酶中是比较少见的。

3 褐藻胶裂解酶的结构和功能

不同褐藻胶裂解酶在初级结构和高级结构虽有较大差别，但在催化中心的结构和必需氨基酸残基的种类上却有一定程度的相似性。如Lys、Arg、His、Ser以及Tyr属于PL-14家族中褐藻胶裂解酶催化中心的保守氨基酸残基，参与酶的催化作用并且是重要的催化位点[16]；RXELREM和YFKAGXY是属于PL-7家族中褐藻胶裂解酶催化中心的保守序列。

目前已有部分褐藻胶裂解酶的结构得到解析。如褐藻胶裂解酶ALY-1[17]的催化位点和结合位点成口袋状结构，利于与底物结合而发生反应。蛋白的三维结构预测显示为β-折叠，ALY-1具有N端YXRSELREM和C端YEKAGGYTQ共有序列，N端共有序列中R(Arg)为活性中心，C端共有序列中Y(Tyr)为活性位点。其中，R与褐藻胶多糖链上的-OH进行反应，Y和Q与位于反应点附近的褐藻胶多糖相互作用，使反应环境稳定。而P.syringae[18]褐藻胶裂解酶主要是由螺旋构成的栅状结构，酶的活性中心包括 Asn、His、Arg 和Tyr，His位于保守序列中，褐藻胶裂解酶结构中包含一个很深的隧道裂缝结构，有利于底物分子的渗入，并与酶催化位点相互作用。此外，LbAly35[19]是属于PL14家族的褐藻胶裂解酶，在它的催化中心有Lys、Arg、Try保守序列位点，其中Lys是LbAly35的催化活性中心。

研究还发现分子质量在40 ku左右的褐藻胶裂解酶催化中心是一个隧道样的裂缝，位于催化中心的Arg、Lys及带有芳香环的氨基酸决定了酶的底物专一性。酶活性中心的保守序列、套环结构等对底物识别和结合有重大作用。Trp、Lys、His以及Cys是酶活性中心的必需氨基酸残基，其中Trp参与了底物的结合，Lys和His直接参与催化反应[20]。而分子质量在30 ku左右的褐藻胶裂解酶氨基酸序列相似性较低，但这一类褐藻胶裂解酶在 C 端均具有半保守的YFKAGVYNQ氨基酸序列，这一序列参与三维构像的维持。30 ku左右的褐藻胶裂解酶具有不同的底物专一性。

4 褐藻胶裂解酶的应用

褐藻胶裂解酶可以用于褐藻寡糖的制备。其通过β消除反应催化褐藻胶降解为褐藻寡糖，作用位点是α-1,4糖苷键，并在非还原末端产生不饱和双键。不饱和双键的产生对寡糖的某些生物活性有重要影响，而利用物理法或化学法降解所获得的寡糖却没有这些特性。这些独特的生物活性增加了褐藻寡糖的应用价值[21]。但是酶法生产褐藻寡糖仍处于研究阶段，距离其工业化大规模生产仍有一段距离。

此外褐藻胶裂解酶还可以用于生物乙醇制备。近年来关于褐藻发酵生产生物乙醇的研究逐渐增多。海藻通过发酵将褐藻酸盐降解成低聚寡糖进而转化成生物乙醇[13]。褐藻胶裂解酶是褐藻发酵生产生物乙醇的关键酶。解决了常见的大肠杆菌不能利用褐藻胶及酿酒酵母和运动发酵单胞菌也不能直接发酵褐藻生成乙醇的问题。如果将褐藻胶裂解酶基因及乙醇发酵途径转入大肠杆菌，构建成可以直接利用褐藻发酵生产乙醇的工程菌，就可以实现褐藻到生物乙醇的直接转化。Wargacki等[22]构建了可以直接利用褐藻发酵生产乙醇的工程菌，其乙醇产量可达到理论值的 80%，因此降解褐藻生产生物乙醇是未来能源研究的热点和重点。

5 褐藻寡糖的应用

5.1 褐藻寡糖在农业生产上的应用

褐藻寡糖同植物内源性寡糖半乳糖醛酸结构相似，并具有类似内源性寡糖的信号分子作用，故在促进植物生长、增强植物抗性及抑制植物病原菌方面有很好的效果。早在20世纪90年代人们就发现褐藻寡糖能促进植物根系生长，Yoshihisa[23〗[24]发现褐藻寡糖可以通过提高叶绿素含量、淀粉酶活力及植株根系活力进而促进大麦种子的萌发和幼苗生长。另外褐藻寡糖对杏鲍菇菌丝体生长速度、生物量及纤维素酶活性均具有促进作用，低浓度寡糖促进作用更明显[25]。目前，关于其作用机理尚在研究中并不明确。

使用褐藻寡糖处理小麦叶片可促进叶片中内源性脱落酸(ABA)积累，可能是通过诱导ABA从头合成途径中的相关合成基因TaNCED、TaAOX和TaBG的表达实现的，最终提高了植株的抗逆性[26]。外施0.4%的褐藻寡糖能明显缓解毒死蜱引起的小麦叶绿素 a、b及总叶绿素含量的降低，脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖增加，增强植物对毒死蜱胁迫的抗性，使毒死蜱对小麦幼苗的伤害明显降低[27]。除此之外，褐藻寡糖还可刺激大豆子叶积累植物抗毒素和丙氨酸解氨酶，抑制铜绿假单胞杆菌。聚合度为6～8的褐藻寡糖对铜绿假单胞菌有抗菌活性。褐藻酸寡糖在诱导大豆获得最高大豆抗毒素含量时，增加了大豆中异黄酮类化合物含量，提高了大豆蛋白质的营养价值[28]。

褐藻寡糖对植物生理调节的多样化及对某些病原菌的抑制作用使其在农业研究中有很大的开发潜力。而且与传统化肥农药相比，褐藻寡糖安全无毒害，不会对生态环境造成迫害。用褐藻寡糖生产农业产品，可以为发展绿色农业提供支撑。

5.2 褐藻寡糖在医药、食品及饲料领域的应用

随着对褐藻寡糖生理活性研究的深入，已有以褐藻寡糖为原料的海洋药物面世。如用于治疗脑血栓、脑栓塞疾病的藻酸双脂钠，治疗艾滋病的新药硫酸寡糖SPMG及抗脑缺血新药989等。褐藻寡糖还可以作为饲料添加剂应用在饲料领域，相比于传统的添加剂褐藻寡糖具有能改变动物消化道微生物菌相、提高动物日增重、饲料转化率、抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等致病菌的优势[29]；亦有研究表明褐藻寡糖在一定浓度下，可以明显缩短双歧杆菌生长的适应期，使双歧杆菌大量生长。是一种有效的双歧杆菌增长因子，对双歧杆菌的生长具有明显的促进作用，故褐藻寡糖可以作为双歧因子，应用于食品领域。关于褐藻寡糖应用于饲料和食品的相关研究报道较少。

6 褐藻胶裂解酶的应用展望

近年来，随着对褐藻胶裂解酶研究的广泛深入，发现褐藻胶裂解酶及褐藻寡糖均具有广泛的用途，这使得褐藻胶裂解酶的商业价值不断提升。目前制约其实现商业化的问题有酶活性低，酶与底物结合紧密，分离困难，产酶菌株为致病菌等。因此利用基因工程、细胞工程等手段对产酶菌株进行改造，或是利用固定化技术对酶进行修饰，突破酶的应用限制是褐藻胶裂解酶实现商业化的重要技术手段。

[1]陈俊帆,石 波,范红玲,等.褐藻胶裂解酶的研究进展[J].食品工业科技,2010,32 (8): 428-431.

[2]王媛媛,郭文斌,王淑芳,等.褐藻寡糖的生物活性与应用研究进展[J].食品与发酵工业,2010,36(10): 122-126.

[3]李丽妍,管华诗,江晓路,等.海藻工具酶——褐藻胶裂解酶研究进展[J].生物工程学报,2011,27(6): 838-845.

[4]DUAN G F,HAN F,YU W.Cloning,sequence analysis,and expression of gene alyPI encoding an alginate lyase from marine bacteriumPseudoalteromonassp.CY24 [J].Canadian Journal of Microbiology,2009,55(9): 1113-1118.

[5]LEE S I,CHOI S H,LEE E Y,et al.Molecular cloning,purification,and characterization of a novel polyMG-specific alginate lyase responsible for alginate MG block degradation inStenotrophomasmaltophiliaKJ-2[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2012,95(6): 1643-1653.

[6]ZHU B W,HUANG L S,TAN H D,et al.Characterization of a new endo-type polyM-specific alginate lyase fromPseudomonassp.[J].Biotechnology Letters,2015,37(2):409-415.

[7]韩 峰.海洋弧菌QY103褐藻胶裂解酶的研究[D].青岛: 中国海洋大学,2008.

[8]汪立平,刘玉佩,孙晓红,等.褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质[J].食品与生物技术学报,2012,31(2): 189-194.

[9]OSTGAARD K,KNUTSEN S H,DYRSET N,et al.Production and characterization of guluronate lyase fromKlebsiellapneumoniaefor applications in seaweed biotechnology[J].Enzyme and Microbial Technology,1993,15(9): 756-763.

[10]WANG Y,GUO E W,YU W G,et al.Purification and characterization of a new alginate lyase from a marine bacteriumVibriosp.[J].Biotechnology Letters,2013,35(5): 703-708.

[11]CAO L,XIE L,XUE X,et al.Purification and characterization of alginate lyase fromSreptomycesspecies strain A5 isolated from banana rhizosphere [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(13): 5113-5117.

[12]ZHU B,TAN H,QIN Y,et al.Characterization of a new endo-type alginate lyase fromVibriosp.W13[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,75: 330-337.

[13]HUANG L,ZHOU J,LI X,et al.Characterization of a new alginate lyase from newly isolatedFlavobacteriumsp.S20[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2013,40(1): 113-122.

[14]KIM H T,KO H J,KIM N,et al.Characterization of a recombinant endo-type alginate lyase(Alg7D) fromSaccharophagusdegradans[J].Biotechnology Letters,2012,34(6): 1087-1092.

[15]郭恩文,王 亚,于文功,等.产双功能褐藻胶裂解酶菌株的筛选与初步研究[J].现代生物医学进展,2013,13(29): 5606-5609.

[16]YAMAMOTO S,SAHARA T,SATO D,et al.Catalytically important amino-acid residues of abalone alginate lyase HdAly assessed by site-directed mutagenesis[J].Enzyme and Microbial Technology,2008,43(6): 396-402.

[17]刘 航,曹海龙,岳 敏,等.褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究[J].华中师范大学学报(自然科学版),2012,46(4): 456-460.

[18]吴丽云,刘 韩,倪 辉,等.Pseudomonassyringae褐藻胶裂解酶基因的克隆及信息学分析[J].集美大学学报(自然科学版),2015,20(3): 179-185.

[19]WANG L,RAHMAN M M,INOUE A,et al.Heat-stability and primary structure of the major alginate lyase isozyme LbAly35 fromLittorinabrevicula[J].Fisheries Science,2012,78(4): 889-896.

[20]OSAWA T,MATSUBARA Y,MURAMATSU T,et al.Crystal structure of the alginate (poly alpha-l-guluronate) lyase fromCorynebacteriumsp.at 1.2 A resolution [J].Journal of Molecular Biology,2005,345(5): 1111-1118.

[21]IWAMOTOA M,KURACHI M,NAKASHIMA T,et al.Structure-activity relationship of alginate oligosaccharides in the induction of cytokine production from RAW264.7 cells [J].FEBS Letters,2005,579(20): 4423-4429.

[22]WARGACKI A J,LEONARD E,WIN M N,et al.An engineered microbial platform for direct biofuel production from brown macroalgae [J].Science,2012,335(6066): 308-313.

[23]YOSHIHISA T,KENJI U,TAKASHI A,et al.Promotion of barley root elongation under hypoxic conditions by alginate lyase-lysate(ALL)[J].Biotechnology & Biochemistry,1994,58(1): 202-203.

[24]王婷婷,赵 丽,夏 萱,等.2种海洋寡糖对大麦种子萌发和生理特性的影响[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2011,41(11): 61-66.

[25]毕旺华,冯晓梅,李建杰,等.褐藻寡糖对杏鲍菇菌丝体生长的影响[J].安徽农业科学,2014,42(31): 10841-10844.

[26]刘 航,冯立强,刘兴江.寡糖对小麦脱落酸合成的影响[J].浙江农业学报,2015,27(1): 12-15.

[27]张守栋,张同作,韩晓弟,等.褐藻胶寡糖对毒死蜱胁迫下小麦幼苗生理生化指标的影响[J].生态学杂志,2015,34(5): 1277-1281.

[28]张迷敏,李静梅,乔 宇,等.褐藻酸寡糖诱导下大豆营养成分的变化[J].中国农业科学,2015,48(16): 3329-3248.

[29]陈 丽,张林维,薛婉立.褐藻寡糖的制备及抑菌性研究[J].中国饲料,2007(9) : 34-35.

Advance in alginate lyases

LUO Dan-dan,XUE Yong-chang

(School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China)

Alginate lyases can catalyze the degradation of alginate,a complex copolymer of L-guluronate and its C5 epimer D-mannuronate,with β-elimination mechanism and yield alginate oligosaccharides.Alginate oligosaccharide has many kinds of biological activities,such as promoting growth,enhancing resistance in plant and bacteriostasis,so that they have attracted more and more people′s attention.In this paper some research progress in the classification,structure,function,enzymatic properties of alginate lyase and the application of alginate oligosaccharides were reviewed.It will provide a theoretical basis for its application in industrial production.

alginate; alginate lyase; alginate oligosaccharides

2015-12-23；

2016-01-08

罗丹丹，硕士生，研究方向为微生物生理，E-mail：luodandan1905@163.com

薛永常，博士，教授，研究方向为分子生物学，E-mail：xueych@dlpu.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2016.06.095

Q939.9

A

2095-1736(2016)06-0095-04