植物生长调节剂对金线莲玻璃化苗复壮与增殖的影响

刘芳，唐映红，李春艳，巩媛，毛凯权，陈建荣*

(1.长沙学院 生物与环境工程学院，湖南 长沙 410022；2.湖南文理学院 生命与环境科学学院，湖南 常德 415000)

金线莲(Anoectochilusroxburghii)为兰科开唇兰属多年生草本植物，别名金线兰、金丝草、树草莲、金钱仔草等.金线莲全草均可入药，其功效范围广泛，主治咯血、肾炎、膀胱炎、风湿性关节炎、肿瘤等疑难病症[1-3].金线莲只能生长在人迹罕至处于原始生态的深山老林内，对坏境要求极为严格.金线莲自然繁殖率低，自然繁殖大量的金线莲非常困难[4].由于生态环境恶化和对金线莲需求的增加，导致野生金线莲资源濒临灭绝[5].常规扦插或嫁接繁殖速度慢、繁殖系数低、成本高，因此难以大规模应用[6].随着科学技术的发展，目前通过植物组织培养方法探索建立金线莲高效稳定的诱导愈伤组织培养系统和进行再生试管苗的培养，可以解决金线莲在国内推广应用的问题，也可以起到保护野生的金线莲资源的作用[7].近年来金线莲的组培技术得到了迅速地发展，但是在诱导愈伤组织的过程中常常会发生试管苗玻璃化的现象，造成试验材料的浪费和试验进度的缓慢.

玻璃化是一种生理失调或者生理病变，是指在植物离体培养的过程中，植物幼苗呈半透明水渍状，玻璃化的植株难以移栽成活[8-10].可通过适当提高光照强度、注意通气、适当降低培养基中铵根离子浓度、细胞分裂素与生长激素配比和钾离子之间的配合使用、控制温度等方法降低或改善组培苗玻璃化[11-12].本试验通过调节生长素和细胞分裂素的配比对金线莲玻璃化组培苗的复壮、以及复壮苗的增殖生长能力进行研究，为金线莲的快速繁殖提供参考.

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为已经玻璃化的金线莲组培丛生芽.

1.2 试验方法

1.2.1 不同生长调节剂配比对玻璃化苗复壮、增殖的影响

以MS为基本培养基，加入不同配比的6-BA和NAA，共设置49种培养基(见表1)，首先对玻璃化苗进行复壮培养，然后将复壮苗移植至新的培养基中进行增殖培养.其中，培养基中蔗糖30 g/L、琼脂9 g/L、pH值5.8.

表1 不同生长调节剂配比

1.2.2 培养条件

上述试验每个处理设10次重复，每瓶接种3～5个外植体.于温度25 ℃、光照强度1 500 lx、光照时间12 h/d条件下连续培养观察芽的复壮、增殖及生长情况.

1.2.3 数据统计与分析方法

复壮和增殖培养30 d后进行统计分析.复壮率=复壮芽数*100/接种的外植体株数，记录10次重复的平均数作为最终结果，以玻璃化苗的叶片变成翠绿色为复壮依据；增殖率=增殖后的总株数/接种的外植体株数，记录10次重复的平均数作为最终结果，并于试验结束时，目测芽生长情况并用5级表示，分别记为：“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”表示，试验数据用DPS软件进行多重比较分析.

2 结果与分析

2.1 不同生长调节剂配比对玻璃化苗复壮的影响

由表2可以看出，49个处理都有不同程度的玻璃化苗复壮，其中以组合F1S1、F2S1、F5S1、F6S1、F7S1及F5S5复壮率较高，均达到了80.0%以上，其中以组合F5S5即2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA复壮效果最好，其复壮率可达到88.9%，培养30 d后，产生大量原球茎(图1-f)，由表3可知，6-BA、NAA两种因素对玻璃化苗复壮均有显著的相关性，说明6-BA、NAA这2种生长调节剂对玻璃化苗都有明显的效果，其中以6-BA效果较好(F=13.794 3)，NAA(F=0.657 9)较差.由表4可知，各因素不同浓度之间的差异也有所不同，不同6-BA浓度之间具有显著性，不同NAA浓度之间无显著性.因此，根据正交试验优先选择原则，结合复壮率的直观分析，两种因素配比时的复壮效果较好，可得出2种因素的最佳配比为F5S5，即MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/ L NAA.

表2 不同生长调节剂配比下玻璃化苗复壮情况(30 d后)Table 2 Recovery of vitrified seedlingsin the proportion of different growth regulators(after 30 days)

表3 玻璃化苗复壮情况方差分析

表4 各因素不同浓度之间玻璃化苗复壮情况方差分析Table 4 Analysis of variance on recovery of vitrified seedlings between different concentrations of various factors

2.2 不同生长调节剂配比对复壮苗增殖生长的影响

由表5的结果可知，金线莲在复壮的基础上都有不同程度的增殖，组合Z1H1、Z1H2、Z1H3、Z1H4、Z1H5、Z1H6、Z1H7增殖效果较好，其中以组合Z1H5的增殖效果最好，增殖率达到了59.8%，其在复壮时产生原球茎，30 d后原球茎上形成大量丛生芽，生长旺盛，长势喜人(图1-g).

表5 复壮苗增殖情况

表6的方差分析结果中F值显示，Z因素和H因素对复壮苗的增殖均有显著的相关性，说明6-BA和NAA这2种生长调节剂配比对复壮苗增殖都有非常明显的效果，其中以6-BA效果较好(F=54.244 4)，NAA较差(F=1.012 5).由表7可知，NAA各浓度之间的差异较小，但6-BA各浓度之间差异较大，通过比较得出：2.0 mg/L 6-BA和0.01 mg/L NAA组合，即Z1H5时的效果最好.因此，适合复壮苗增殖的培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA.

表6 复壮苗增殖情况方差分析Table 6 Analysis of variance on proliferation of resuscitated seedlings

表7 各因素不同浓度之间复壮苗增殖情况方差分析Table 7 Analysis of variance on proliferation of resuscitated seedlings between different concentrations of various factors

图1 金线莲玻璃化苗恢复情况Fig.1 Restoration of vitrified seedling of Anoectochilus auriculata

3 讨论

植物玻璃化是植物组织培养中常见的现象，易导致试验材料的浪费及试验进度的缓慢.已有文献指出，玻璃化苗随着培养基和培养环境的改变其变化是可逆的[8，13-15].目前已知的玻璃化苗复壮的方法包括增强通风[7]、适度的低温处理[16]、改变pH[17]、激素配比[18]和加入活性炭[19]等.本试验从激素配比方面进行研究，探讨不同的生长素和细胞分类素配比对玻璃化苗复壮的影响，结果显示，不同的激素配比对玻璃化苗复壮有着显著的影响，其中MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的组合效果最佳，玻璃化苗复壮率达88.9%，玻璃化苗对6-BA更加敏感，复壮率随6-BA浓度的变化，波动较大，高浓度的NAA、6-BA均不利于玻璃化苗的复壮.

本试验在玻璃化苗复壮的基础上取到了较好的再增殖效果.不同的激素配比组合中金线莲原球茎增殖40倍～50倍，其中MS+2.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA试验组增殖率达到59.8%.6-BA对金线莲的增殖影响较大，NAA的影响较弱，金线莲增殖率随6-BA浓度变化波动较大，王雅英等[14]通过正交试验也认为6-BA、NAA、KT三种激素对金线莲增殖系数影响大小为6-BA>NAA>KT.当然也有其他的研究者提出不同的增殖或诱导的配方，如王健勤等[20]提出的改良MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/LKT原球茎诱导配方，陈兆贵[21]提出的MS +2.0 mg/L ～3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L～0.5 mg/L NAA增殖配方.

4 结论

MS +2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA是最佳的金线莲玻璃化苗的复壮培养基，玻璃化苗复壮率达88.9%.复壮后的玻璃化苗最佳增值培养基是MS+2.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，接种在该培养基中的金线莲苗产生原球茎，增殖率达到59.8%.本试验在玻璃化苗复壮的基础上获得了较高的增殖率，增殖效果好，对金线莲的快速繁殖具有重要参考价值.