基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别金线兰及其近缘种

吴岩斌，张 超，吴建国，吴锦忠*，郑承剑

• 药材与资源 •

基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别金线兰及其近缘种

吴岩斌1，张 超1，吴建国1，吴锦忠1*，郑承剑2*

1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122 2. 海军军医大学 药学系中药鉴定学教研室，上海 200433

应用ITS2和psbA-trnH条形码鉴定金线兰及其近缘种。提取金线兰及其近缘种的DNA，对ITS2和psbA-trnH序列进行扩增和测序，计算物种种内、种间遗传距离，构建邻接法（neighbor-joining，NJ）系统聚类树直观反映鉴定结果。经PCR扩增后测序，金线兰及其近缘种ITS2序列长度为250～254 bp，GC含量为48.2%～51.6%；psbA-trnH序列长度为636～704 bp，GC含量为31.8%～32.0%。根据K2P遗传距离计算，金线兰的种内遗传距离明显小于种间遗传距离。基于ITS2序列构建的NJ树结果显示，除长片金线兰外，金线兰与其余混伪品可以明显区分。基于psb A-trnH序列构建的NJ树结果显示，除长片金线兰和丽蕾金线兰外，金线兰与其余金线兰属近缘种可以明显区分。ITS2和psb A-trnH序列可以鉴别金线兰与其遗传距离较远的近缘种。

金线兰属；金线兰；DNA条形码；ITS2序列；psbA-trnH序列

目前，全世界有金线兰属Blume植物40余种，中国有20种（10个特有种），其中金线兰(Wall.) Lindl分布最广，储量相对较多，分布于福建、浙江、江西、云南、广西、湖南等地区，是福建特色中草药金线莲的基原植物[1-4]。金线莲具有清热凉血、祛风利湿、解毒的功效[4]，具有保肝、降血糖、抗类风湿性关节炎、抗骨质疏松、减肥等生物活性[5-9]，临床上主要用于治疗肝炎、手足口病、糖尿病等疾病，显示出良好的应用前景[10-14]。课题组在前期金线莲资源调查过程中发现，除金线兰外，台湾银线兰、丽蕾金线兰、兴仁金线兰、长片金线兰、高金线兰和滇南金线兰等金线兰属植物在民间均被当作金线莲使用。此外，一些斑叶兰属、血叶兰属和齿唇兰属植物也常混作金线莲使用。金线兰及其近缘种形态特征相似，从外观上难以进行快速准确地鉴定，容易造成混用，影响金线莲临床疗效的稳定。因此准确鉴别金线兰，对保障金线莲药材质量具有重要的意义。本研究选用ITS2和psbA-trnH 2条序列对金线兰及其近缘种进行分子鉴定，以期为金线兰的快速鉴定及其开发提供参考。

1 材料

1.1 材料

金线兰及其近缘种样品采自福建、江西、广东、广西、云南等地（采样时间2016年3～8月），由福建中医药大学药学院黄泽豪教授和吴锦忠教授鉴定为金线兰(Wall.) Lindl.、台湾银线兰Hayata、兴仁金线兰Z. H. Tsi & X. H. Jin、丽蕾金线兰Rolfe ex Downie、长片金线兰H. Jiang & H. Z. Tian、滇南金线兰Rolfe、高金线兰Lindl.、血叶兰(Ker-Gawl.) A. Rich.、大花斑叶兰(Lindl.) Hook. f.、斑叶兰Rchb. F.、小小斑叶兰(L.) R. Br.、小斑叶兰s (L.) R. Br.、西南齿唇兰C. B. Clarke ex Hook. f.、艳丽齿唇兰(Parish et Rchb. f.) T. Tang et F. T. Wang，凭证标本保存于福建中医药大学药学院。样品信息见表1。

1.2 仪器及试剂

S1000 Thermal Cycler PCR扩增仪（美国BIO-Rad公司）；凝胶成像系统（美国BIO-Rad公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；Tris碱（合肥biosharp生物科技有限公司）；β-巯基乙醇（Genview公司）；Tris饱和酚（美国Solarbio公司）；DL2000 DNA marker（TaKaRa公司）；PrimeSTAR Max dna Polymerase（TaKaRa公司）；GoldView（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；6×DNA Loading Buffer（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；琼脂糖（Genview公司）。

表1 样品信息

Table 1 Sample information

编号拉丁名中文名代码采集地 1A. roxburghii金线兰AR1福建漳州 2 AR2福建漳州 3 AR3福建漳州 4 AR4福建漳州 5 AR5福建龙岩 6 AR6江西赣州 7 AR7广东清远 8 AR8广东清远 9 AR9广西南宁 10 AR10福建漳州 11 AR11福建龙岩 12 AR12福建漳州 13 AR13福建漳州 14 AR14福建漳州 15 AR15福建三明 16 AR16福建漳州 17 AR17福建漳州 18 AR18福建龙岩 19A. formosanus台湾银线兰AF1福建漳州 20 AF2福建漳州 21 AF3福建漳州 22 AF4福建漳州 23 AF5福建漳州 24A. xingrenensis兴仁金线兰AX1广西南宁 25 AX2广西河池 26 AX3广西南宁 27A. lylei丽蕾金线兰LY1广西南宁 28 LY2广西南宁 29A. longilobus长片金线兰AL云南文山 30A. burmannicus滇南金线兰AB云南德宏 31A. elatus高金线兰AE云南西双版纳 32Ludisia discolor血叶兰LD1广西南宁 33L. discolor血叶兰LD2广西南宁 34Goodyera biflora大花斑叶兰GB贵州兴义 35G. schlechtendaliana斑叶兰GS浙江丽水 36G. yangmeishanensi小小斑叶兰GY广西河池 37G. repens小斑叶兰GW云南怒江 38Odontochilus elwesii西南齿唇兰OE云南麻栗坡 39O. moulmeinensis 艳丽齿唇兰OM云南麻栗坡

2 方法

2.1 样品DNA的提取、PCR扩增和测序

取经过硅胶干燥的植物叶片约0.5 g，经液氮研磨后，用改良的CTAB法提取总DNA[15]。各候选序列的PCR反应条件，通用引物及扩增程序参考陈士林等的研究[16]。PCR扩增产物经纯化后，使用ABI3730型基因分析仪进行双向测序。

2.2 数据处理

测序所得到的峰图采用Contig Express v 3.0（Codon Code Co.，美国）校对拼接，去除引物区及低质量区。使用隐马尔可夫模型HM-Mer序列注释方法去除两端5.8S和28S区段，获得ITS2序列[17]。通过与GenBank序列进行Blastn比对，并通过参考序列进行注释，获得psbA-trnH序列[18]。利用MEGA 5.05对序列进行比对分析，比对后的序列统计GC含量，同时采用Kimura-2-Parameter（K2P）模型计算遗传距离，并基于邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，利用bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增产物检测

金线兰及其部分近缘种样品的PCR扩增成功率均为100%，经琼脂糖凝胶电泳得到PCR扩增电泳图（图1），扩增效果较好，条带较亮，没有拖尾现象，ITS2序列在500 bp左右，psbA-trnH序列在750～1000 bp。

M-Marker CK-空白对照，1～31为表1中样品

3.2 ITS2和psbA-trnH序列的GC含量分析

通过MEGA5.05软件对金线兰及其近缘种ITS2和psbA-trnH序列的GC含量进行分析，结果显示（表2），样品1～39的ITS2序列长度为250～254 bp，其中金线兰与长片金线兰、滇南金线兰的GC含量均为48.2%，金线兰与台湾银线兰、兴仁金线兰、丽蕾金线兰、高金线兰、斑叶兰、大花斑叶兰、小小斑叶兰、小斑叶兰、血叶兰、西南齿唇兰和艳丽齿唇兰的GC含量差异分别为0.4%、0.4%、0.4%、0.8%、1.4%、2.2%、1.0%、3.4%、1.8%、2.6%和0.8%。样品1～31的psbA-trnH序列长度为693～704 bp，其中金线兰与台湾银线兰的GC含量均为31.8%，金线兰与兴仁金线兰、丽蕾金线兰、长片金线兰、滇南金线兰、高金线兰的GC含量差异分别为0.2%、0.1%、0.1%、0.2%和0.2%。

表2 ITS2和psbA-trnH序列长度及其GC含量

Table 2 Length and GC content of ITS2 and psbA-trnH sequences

编号代码序列长度/bpGC含量/% ITS2psbA-trnHITS2psbA-trnH 1AR 125369548.231.8 2AR 225369548.231.8 3AR 325369548.231.8 4AR425369448.231.8 5AR525369548.231.8 6AR625369448.231.8 7AR725369548.231.8 8AR825369548.231.8 9AR925369548.231.8 10AR1025369448.231.8 11AR1125369548.231.8 12AR1225369448.231.8 13AR1325369548.231.8 14AR1425369548.231.8 15AR1525369448.231.8 16AR1625369548.231.8 17AR1725369548.231.8 18AR1825369448.231.8 19AF125370148.631.8 20AF225370148.631.8 21AF325370148.631.8 22AF425370148.631.8 23AF525370248.631.8 24AX125369348.632.0 25AX225369348.632.0 26AX325369348.632.0 27LY125363648.631.9 28LY225363648.631.9 29AL25369548.231.9 30AB25370448.232.0 31AE25370449.032.0 32LD1250 50.0 33LD2250 50.0 34GB252 50.4 35GS252 49.6 36GY254 49.2 37GR252 51.6 38OE250 50.8 39OM251 49.0

3.3 遗传距离分析

ITS2序列种内种间K2P遗传距离结果显示（表3），金线兰种内遗传距离为0，金线兰与长片金线兰的种间遗传距离为0，金线兰与兴仁金线兰、丽蕾金线兰、长片金线兰、滇南金线兰、高金线兰的种间遗传距离分别为0.004 0、0.004 0、0.004 0、0.012 0、0.008 0。金线兰与斑叶兰、大花斑叶兰、小小斑叶兰、小斑叶兰、血叶兰、西南齿唇兰和艳丽齿唇兰的种间遗传距离分别为0.104 1、0.113 5、0.108 3、0.108 6、0.099 2、0.080 8、0.063 0。结果说明，基于ITS2序列的遗传距离，可以鉴别金线兰与兴仁金线兰、丽蕾金线兰、长片金线兰、滇南金线兰、高金线兰、斑叶兰、大花斑叶兰、小小斑叶兰、小斑叶兰、血叶兰、西南齿唇兰和艳丽齿唇兰等近缘种混伪品，但是不能鉴别金线兰与长片金线兰。

psbA-trnH序列种内种间K2P遗传距离结果显示（表3），金线兰种内遗传距离为0，金线兰与台湾银线兰、兴仁金线兰、丽蕾金线兰、长片金线兰、滇南金线兰、高金线兰的种间遗传距离分别为0.001 6～0.007 3，明显大于金线兰种内遗传距离。结果表明，基于psbA-trnH序列的遗传距离可作为鉴别金线兰与其他近缘种混伪品的重要依据。

3.4 金线兰及其同属近缘种NJ树的鉴定

利用邻接法（NJ）构建金线兰与其近缘种的ITS2、psbA-trnH序列的NJ系统发育树。ITS2序列构建的NJ树结果显示（图2），金线兰与长片金线兰聚为一支，兴仁金线兰、丽蕾金线兰、台湾银线兰、和滇南金线兰聚为一支、高线兰单独聚为一支，西南齿唇兰、艳丽齿唇兰和血叶兰聚为一支，斑叶兰、大花斑叶兰、小小斑叶兰和小斑叶兰聚为一支。基于ITS2序列构建的NJ树结果显示，除长片金线兰外，金线兰与其余近缘种混伪品可以明显区分。psbA-trnH序列构建的NJ树结果显示（图3），18批金线兰单独聚为一支，台湾银线兰、丽蕾金线兰、兴仁金线兰、长片金线兰也各自聚为一支，高金线兰和滇南金线兰聚为一支，基于psbA-trnH序列构建的NJ树结果显示，金线兰与台湾银线兰、兴仁金线兰、高金线兰和滇南金线兰可以区分开；但是金线兰与丽蕾金线兰、长片金线兰较难区分，其支持率只有39%，并未达到物种鉴定的标准。

表3 基于ITS2和psbA-trnH序列的金线兰及其近缘种的K2P遗传距离

Table 3 K2P genetic distances of A. roxburghii and its closely related species based on ITS and psbA-trnHsequences

类别ITS2遗传距离psbA-trnH遗传距离 金线兰种内 0 0 金线兰与台湾银线兰种间0.004 00.002 9 金线兰与兴仁金线兰种间0.004 00.004 3 金线兰与丽蕾金线兰种间0.004 00.001 6 金线兰与长片金线兰种间00.001 4 金线兰与滇南金线兰种间0.012 00.007 3 金线兰与高金线兰种间0.008 00.007 3 金线兰与斑叶兰0.104 1 金线兰与大花斑叶兰0.113 5 金线兰与小小斑叶兰0.108 3 金线兰与小斑叶兰0.108 6 金线兰与血叶兰0.099 2 金线兰与西南齿唇兰0.080 8 金线兰与艳丽齿唇兰0.063 0

图2 基于NJ法（ITS2数据）构建系统发育树

图3 基于NJ法(psbA-trnH数据) 构建系统发育树

4 讨论

核基因ITS2片段和叶绿体基因psbA-trnH片段作为国际通用条形码序列，被广泛应用于药用植物的分子鉴定[19]。目前，鲜有文献对多种金线兰属植物的DNA条形码进行研究。Lv等[20]在对金线兰、台湾银线兰、血叶兰、斑叶兰等4个物种DNA条形码研究中发现，ITS2可以将金线兰与同属植物台湾银线兰、血叶兰属植物血叶兰、斑叶兰属植物斑叶兰区分开，其研究结果与本试验的ITS2结果一致，但应用核糖体ITS2 序列却无法鉴别金线兰与长片金线兰。同时，本研究单独应用叶绿体psbA-trnH序列可较好的鉴别金线兰与台湾银线兰、兴仁金线兰、高金线兰和滇南金线兰，但不能用于鉴别金线兰与丽蕾金线兰、长片金线兰。研究表明，物种间的GC含量差异可反映其亲缘关系的远近[21]。本研究通过对金线兰及其近缘种ITS2序列的GC含量差异分析可知，长片金线兰与金线兰的GC含量没有差异，系统发育树中可见长片金线兰与金线兰聚为一支；而在ITS2序列中，滇南金线兰与金线兰的GC含量也没有差异，但在系统发育树中滇南金线兰与金线兰却没有聚为一支。psbA-trnH序列的GC含量差异分析显示，丽蕾金线兰和长片金线兰二者与金线兰GC含量差异均为0.1%，说明二者与金线兰亲缘关系较近，在系统发育树中可见金线兰、丽蕾金线兰和长片金线兰聚为一大支。因此，序列的GC含量与金线兰属植物的亲缘关系是否存在必然联系还有待进一步研究。综上所述，ITS2和psb A-trnH序列可以鉴别金线兰与其遗传距离较远的近缘种，而金线兰与长片金线兰的鉴别还需进一步研究。此外，金线兰属植物种类较多，后续研究有必要进一步扩大取样范围。本研究工作可为金线莲基原植物的鉴定及金线兰属植物的亲缘关系与分类提供有益借鉴。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Identification ofand its closely related species based on ITS2 and psbA-trnH sequences

WU Yan-bin1, ZHANG Chao1, WU Jian-guo1, WU Jin-zhong1, ZHENG Cheng-jian2

1. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China 2. Department of Chinese Medicine Authentication, Faculty of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

To identifyand its closely related species using ITS2 and psbA-trnH barcode.Total genomic DNA was isolated fromand its related species. Nuclear DNA ITS2 and chloroplast gene psbA-trnH sequences were amplified and sequenced. The Kimura 2-parameter (K2P) distances were calculated. Identification analyses was performed using Neighbor-joining (NJ) methods.After PCR amplification, the ITS2 regions of tested samples were sequenced and their lengths were from 250—254 bp, and the GC content was 48.2%—51.6%. The lengths of psbA-trnH regions ranged in size from 636 to 704 bp, with GC content ranging from 31.8%—32.0%. Based on K2P model, the intra-specific genetic distances ofin ITS2 and psbA-trnH regions were smaller than the inter-specific ones ofwith its closely related species. The NJ tree based on ITS2 sequence showed thatcan be distinguished clearly from its adulterants except for, while the NJ tree based on psbA-trnH sequence showed thatcan be distinguished clearly from otherspecies except forandITS2 and psbA-trnH sequences can be used as potential DNA barcode to distinguishfrom its related species with genetic distances.

Blume;(Wall.) Lindl; DNA barcoding; ITS2 sequences; psbA-trnH sequences

R286.2

A

0253 - 2670(2022)18 - 5807 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.023

2022-04-28

国家自然科学基金资助项目（82174081，81773846）；福建省科技厅高校产学合作项目（2020Y4015）；上海市浦江人才计划（21PJD082）

吴岩斌（1982—），男，副研究员，研究方向为中药药效物质及品质评价。E-mail: wxsq1@163.com

吴锦忠，教授，研究方向为中药药效物质及品质评价。E-mail: jinzhongfj@126.com

郑承剑，教授，研究方向为中药药效物质及品质评价。E-mail: cjzheng1984@126.com

[责任编辑 时圣明]