PES1对肝细胞癌预后和肝癌BEL-7402细胞生长的影响

答秀维赵超朱芳芳杜姣孟伦李娜张洪新袁鹏作者单位：70038 西安 空军军医大学第二附属医院疼痛科，神经内科

肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是其中最常见的类型。近年来随着包括外科手术及靶向药物等多种方法的肝癌综合治疗不断进步，患者总生存期（overall survival，OS）得以改善，但死亡率仍居高不下［1-2］。随着精准医疗时代的到来，要求以个人基因组信息为基础，结合蛋白质组学、基因组学等信息，针对分子生物病理学特征，制定个体化诊断和治疗策略。pescadillo核糖体生物发生因子1（pescadillo ribosomal biogenesis factor 1，PES1）是对哺乳动物60S核糖体亚基合成具有重要作用的一种蛋白，参与核糖体的生成过程及胚胎发育，PES1高表达能促进细胞周期转换及细胞增殖［3-4］。PES1异常表达还与多种肿瘤的发生发展密切相关，如PES1高表达可促进乳腺癌、卵巢癌及胃癌的发生发展［5-7］。以往研究亦发现PES1在HCC中的表达异常升高、且与预后有关［8-9］，但其在HCC中发挥的具体作用及能否作为预后标志物仍未明确。本研究检测PES1在HCC癌组织中的表达并分析其与患者预后的关系及对肝癌BEL-7402细胞生长的影响，以期为HCC预后判断和分子靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 临床标本及随访

收集2001—2015年在空军军医大学第二附属医院接受手术切除的95例HCC患者的癌组织及相应癌旁正常组织（距离癌灶边缘3 cm范围内）。术前肝功能Child分级为A级或B级，临床病理等资料完整。其中男性80例；＜55岁44例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期72例；细胞分化程度Ⅰ+Ⅱ级58例。本研究通过空军军医大学第二附属医院伦理委员会审核批准，患者知情同意。

采用电话或回院复查进行随访，每隔半年随访1次，末次随访时间为2016年7月，中位随访时间为30.6个月（3.5～78.0个月），以患者死亡、失访或最后随访时间为终点，统计存活、死亡、失访人数。OS定义为自手术至患者死亡或末次随访的时间。

1.2 GSE数据库

在NCBI中选择肝细胞癌GSE14520、GSE22058、GSE25097数据集（均为 Expression profiling by array）。共下载521例HCC患者数据，其中仅GSE14520数据集提供OS情况，年龄为21～77岁。GSE14520数据集的223例HCC按PES1的mRMA表达量中位数（5.744）分为 PES1低表达组（n=112）和PES1高表达组（n=111）。

1.3 细胞和主要试剂

肝癌BEL-7402细胞购自中国科学院上海细胞库；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；PES1 特异性 siRNA（siPES1-1、siPES1-2）及阴性对照siRNA购自上海吉玛公司（siRNA序列分别为siPES1-1：GGAACACUGUAGAGCGUUUAA；siPES1-2：GAAGAUGCAGAGGCUGGUUCA；siCtrl：UUCUCCGAACGUGUCACGU）；兔多克隆抗体PES1购自NOVUS公司；兔多抗β-actin抗体、兔多抗CDC25A抗体、兔多抗CDK4抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；羊抗兔二抗购自上海碧云天生物技术有限公司；MTS试剂购自Promega公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自上海贝博电子信息技术有限公司。

1.4 细胞培养及转染

将肝癌BEL-7402细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2的条件下培养；按4×105/孔接种至6孔板中，待细胞培养至汇合度80%时，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明，分别转染阴性对照siRNA和PES1特异性siRNA（siPES1-1、siPES1-2），并依次记为 siCtrl组、siPES1-1组和siPES1-2组。转染48 h后，收集细胞待用。

1.5 免疫组化检测PES1在HCC癌组织中的表达

HCC癌组织样本病理石蜡切片，经脱蜡、高温高压抗原修复、3% H2O2溶液浸泡后，用山羊血清封闭，抗PES1多克隆抗体（1∶300）4℃下过夜孵育，二抗稀释液（1∶2 000）37 ℃孵育 20 min，辣根过氧化物酶孵育20 min，DAB显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化、脱水，中性树胶封固。结果判读：每张切片在400×视野下随机选5个不同视野。阳性染色细胞百分比评分：<5%为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、76%～100%为4分。染色程度评分：未染色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。两组评分相乘得到的分数为PES1最终染色得分。按照中位数法，将染色评分＜6分定义为PES1低表达组，评分≥6分定义为PES1高表达组。PES1阳性表达定位于细胞核和细胞质。

1.6 Western blot检测BEL-7402细胞中相关蛋白的表达

将转染48 h的各组BEL-7402细胞用胰蛋白酶消化，加入细胞裂解液进行裂解，提取各组细胞总蛋白。蛋白样品经10%的SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入抗PES1多克隆抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 漂洗；加入二抗，室温孵育2 h，TBST漂洗；ELC显影后观察结果。利用Image J软件对Western blot条带进行灰度定量分析，蛋白表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。实验重复3次。

1.7 MTS法检测BEL-7402细胞生长情况

将BEL-7402细胞接种于96孔板，每孔加入100 μL培养液。设5个复孔，于37℃、5% CO2条件下培养。培养24 h后，每孔加20 μL的MTS试剂，于37℃继续孵育2 h，使用酶标仪检测490 nm波长处的吸光度（A）值；同等条件下以加入无细胞的培养液作为空白对照组。连续检测4 d。

1.8 流式细胞术检测BEL-7402细胞周期变化情况

转染48 h后，收集各组细胞，调整细胞密度为1×106·mL-1。PBS清洗后加入预冷 75%乙醇，4℃孵育过夜。离心收集各组细胞，分别加入20 μL的RnaseA，37℃孵育30 min，400目筛网过滤细胞悬液；加入400μL PI，混匀，4℃避光孵育1 h。用流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用细胞周期分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。实验重复3次。

1.9 流式细胞术检测BEL-7402细胞凋亡情况

转染48 h后，收集各组细胞，用PBS洗涤后，加入500 μL的Binding Buffer重悬细胞（细胞悬液浓度为1×106·mL-1），加入5 μL ANXA5-FITC染料和5 μL PI染料，混匀，4℃避光孵育15 min。流式细胞仪激发光波长用488 nm，用波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长>560 nm的滤器检测PI。实验重复3次。

1.10 统计学方法

采用SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 7.0软件进行数据分析。计量数据采用均数±标准差（±s）表示，采用配对t检验比较HCC癌组织及其癌旁正常组织中PES1蛋白表达水平的差异；采用χ2检验分析PES1蛋白表达水平与临床病理参数间的关系。多组均数比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，进一步的多重比较采用Dunnett t检验。采用Kaplan-Meier法计算生存率，根据95例HCC患者PES1的蛋白表达及GSE14520数据中PES1的mRMA表达量的中位数将患者分为低表达组和高表达组，组间生存曲线的比较采用Log-rank检验。采用Pearson相关检验分析 PES1和CDK4、CDC25A、CCNA2、CCNE1、CCND1、CDK2、CDK6 mRNA表达水平的关系。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PES1在HCC癌组织中的表达情况

免疫组化染色结果显示，HCC癌组织的染色评分高于癌旁正常组织［（6.30±3.56）分 vs（2.10±1.64）分，t=10.423，P<0.001）］。根据PES1免疫组化染色评分结果，95例HCC癌组织中，48例（50.5%）PES1低表达，47例（49.5%）PES1高表达。HCC癌组织中PES1表达阳性率高于癌旁正常组织（90.5% vs 72.6%，χ2=10.122，P=0.001），见图1。分析GSE14520、GSE22058、GSE25097数据集中521例HCC患者的基因表达谱数据，结果亦发现PES1在癌组织中的表达均高于癌旁正常组织（均P<0.001），见图2。

图1 PES1在HCC癌组织中的表达Fig.1 Expression of PES1 protein in HCC tissues

图2 GSE14520、GSE22058、GSE25097数据集中HCC癌组织和癌旁正常组织中PES1 mRNA表达Fig.2 Expression of PES1 mRNA in HCC tissues and adjacent normal tissues from GSE14520，GSE22058 and GSE25097

2.2 PES1表达水平与HCC患者临床病理特征的关系

PES1表水平达与HCC患者的肿瘤大小、门脉癌栓和TNM分期有关（均P<0.05），见表1。

表1 PES1表达水平与HCC患者临床病理特征的相关性Tab.1 Correlation between the expression level of PES1 and clinicopathological characteristics of HCC patients

2.3 PES1表达与HCC患者预后的关系

95例HCC患者中，Kaplan-Meier法分析结果显示，PES1低表达组1年、3年、5年总生存率分别为88.7%（95% CI：82.7～94.8%）、81.3%（95% CI：73.9%～88.8%）、64.5%（95% CI：55.3%～73.7%）；PES1 高表达组分别为 78.2%（95% CI：70.2%～86.3%）、52.3%（95% CI：42.3%～62.3%）、36.6%（95% CI：21.3%～51.9%），两组生存曲线比较差异有统计学意义（χ2=4.590，P=0.032），见图3A。

GSE14520数据集中（n=233），PES1低表达组1年、3年、5年总生存率分别为90.8%（95% CI：85.3%～96.3%）、73.5%（95% CI：65.1% ～81.9%）、65.2%（95% CI：56.0%～74.4%）；PES1高表达组分别为 83.8%（95% CI：76.7%～90.9%）、60.2%（95% CI：50.8%～69.6%）、50.0%（95% CI：39.5%～60.7%），两组生存曲线比较差异有统计学意义（χ2=4.269，P=0.039），见图 3B。

图3 PES1蛋白表达水平与HCC患者术后总生存的关系Fig.3 Relationship between the protein expression level of PES1 and postoperative overall survival of HCC patients

2.4 成功构建PES1敲除的BEL-7402细胞

BEL-7402细胞转染PES1小干扰RNA后，用Western blot检测转染效果。siCtrl组、siPES1-1组和siPES1-2组的PES1相对蛋白表达量分别为1.047±0.199、0.266±0.146和0.232±0.103，3 组间差异有统计学意义（F=26.827，P<0.001），进一步多重比较发现，siPES1-1组和siPES1-2组的PES1相对蛋白表达水平均低于siCtrl组（均P<0.001），见图4。

2.5 敲低PES1表达抑制肝癌细胞的生长

MTS法检测结果显示，转染后第3天，siCtrl组、siPES1-1组和siPES1-2组的吸光度值分别为0.650±0.058、0.344±0.025、0.374±0.015，3 组间差异有统计学意义（F=99.535，P=0.001），进一步多重比较发现，siPES1-1组和siPES1-2组的生长能力均低于siCtrl组（均 P＜0.01）。见图 5。

图4 Western blot检测BEL-7402细胞中PES1的干扰效果Fig.4 The interference effect of PES1 in BEL-7402 cells detected by Western blot

图5 MTS法检测转染后BEL-7402细胞生长的情况Fig.5 The growth of BEL-7402 cells after transfection detected by MTS assay

2.6 敲低PES1的表达抑制肝癌细胞G1/S期转换

BEL-7402细胞转染小干扰RNA 48 h后，用流式细胞仪检测细胞周期（图6），结果siCtrl组、siPES1-1组和siPES1-2组的 G1期比例分别为（64.877±2.640）%、（80.977±4.487）%、（80.073±3.717）%，3 组间差异有统计学意义（F=17.986，P=0.003），进一步多重比较发现，siPES1-1组和siPES1-2组细胞G1期比例高于 siCtrl组（均 P＜0.01）；siCtrl组、siPES1-1 组和siPES1-2组的S期比例分别为（23.320±2.934）%、（9.993±3.478）%、（10.653±4.344）%，3 组间差异有统计学意义（F=12.827，P=0.007），进一步多重比较发现，siPES1-1组和siPES1-2组细胞S期比例低于siCtrl组（均 P＜0.01）。见图 6。

2.7 敲低PES1表达对BEL-7402细胞凋亡的影响

BEL-7402细胞转染小干扰RNA 48 h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡（图7），结果siCtrl组、siPES1-1组和siPES1-2组的细胞凋亡比例分别为（11.000±1.400）%、（15.267±2.815）%、（14.300±2.307）%，3 组间差异无统计学意义（F=2.967，P=0.127）。

图6 流式细胞术检测转染后BEL-7402细胞的细胞周期Fig.6 The cell cycle of BEL-7402 cells after transfection detected by flow cytometry

图7 流式细胞术检测转染后BEL-7402细胞的调亡情况Fig.7 The apoptosis of BEL-7402 cells after transfection detected by flow cytometry

2.8 PES1促进肝癌细胞G1/S期转换的机制分析

在3个肝癌公共数据集中CDK4、CDC25A与PES1的表达均呈正相关（图8A～B），未发现 CCNA2、CCNE1、CCND1、CDK2、CDK6与 PES1表达有关（图 8C～G）。为确定 G1/S期转换关键分子 CDK4、CDC25A与PES1的关系，在肝癌BEL-7402细胞中敲低PES1表达后，使用Western blot检测CDK4和CDC25A的表达变化（图9）。结果显示，siCtrl组、siPES1-1组和siPES1-2组CDK4、CDC25A相对蛋白表达水平组间差异均有统计学意义（F=15.388，P=0.004；F=56.603，P<0.001），进一步多重比较发现，siPES1-1组和siPES1-2组的CDK4、CDC25A相对蛋白表达水平均低于siCtrl组（均 P<0.01）。

图8 PES1与细胞G1/S期转换关键分子的相关性Fig.8 Correlation between PES1 and key molecules in G1/S phase transition of cells

图9 Western blot检测转染后BEL-7402细胞中CDK4和CDC25A蛋白表达Fig.9 Expression of CDK4 and CDC25A proteins in BEL-7402 cells after transfection detected by Western blot

3 讨论

目前HCC临床早期诊断除了甲胎蛋白外，尚无其他诊断和预后评估特异性标志物，患者就诊时多数处于中晚期，术后易肿瘤复发和转移［10-11］。研究发现，在恶性肿瘤发生发展中，肿瘤细胞快速增殖需组装大量核糖体，因此核糖体相关蛋白表达常发生改变［12］，而PES1在60S前核糖体组装过程中发挥重要功能。本研究通过3个肝癌数据库（GSE14520、GSE22058、GSE25097）分析发现PES1在HCC癌组织中高表达，利用自有样本进行免疫组化检测，发现95例HCC癌组织中PES1蛋白表达水平同样高于癌旁正常组织，且在HCC癌组织中PES1阳性率较高，进一步分析发现PES1表达水平与肿瘤大小、门脉癌栓和TNM分期等临床特征有关，且高表达与不良预后有关，提示PES1在HCC中可能发挥促癌作用。

基因功能是在细胞组成的多层次复杂生命体中实现的，而癌细胞的生长、增殖、转移等异于正常细胞的特性正是依靠癌基因的持续激活实现。有研究发现PES1可促进肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2生长［13］。FU等［8］亦报道PES1可促进肝癌细胞系Hepa 1-6生长、转移、侵袭，但其具体机制尚未完全清楚。在结直肠癌研究中显示，PES1可通过其C端保守的BRCT域而参与细胞DNA损伤修复反应［14］。而在乳突状甲状腺癌中发现，PES1可通过上调ERα/ERβ蛋白速率促进其发生和进展［15］。CHENG 等［16］还发现 PES1可调控端粒酶的组装，并对细胞衰老产生作用。在胰腺癌中发现PES1可增强c-Myc的表达进而促进其进展［17］。本研究通过构建PES1敲低的肝癌BEL-7402细胞，发现敲低PES1可抑制肝癌BEL-7402细胞生长，与前述发现PES1表达水平与肿瘤大小相关的结果一致。细胞生长是由细胞增殖和凋亡共同构成的一种表现，而细胞增殖又与细胞周期密切相关。本研究通过流式细胞术进一步检测PES1对细胞周期和凋亡的作用，发现敲低PES1能明显抑制肝癌细胞G1/S期的转换，进而抑制肝癌细胞增殖，但是对细胞凋亡作用不明显。为进一步探讨PES1促进细胞周期转换的分子机制，本研究通过GSE14520、GSE22058、GSE25097数据库分析PES1与细胞G1/S转换过程中关键分子的相关性，结果发现PES1和CDK4、CDC25A呈正相关。而在肝癌BEL-7402细胞中敲低PES1表达后，CDK4和CDC25A表达亦下调，推测PES1可能通过上调CDK4和CDC25A的表达进而促进肝癌细胞G1/S期的转换，从而致使肝癌恶性生长。

本研究发现，PES1在HCC癌组织中呈高表达，且与患者不良预后有关。PES1可通过上调CDK4、CDC25A蛋白表达，加快细胞G1/S期的转换，促进肝癌细胞生长。但本研究样本量及临床特征数据收集有限，上述结论仍需扩大样本量并进行多中心验证，PES1促进HCC细胞G1/S期转换的具体分子机制也仍需进一步研究。