YEATS2在肝细胞癌中的表达及临床意义

李世超 许文娟 王玉兰

作者单位：830000 乌鲁木齐 新疆军区总医院1病理科，2卫勤部

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六位发病和第三位死因的癌症，目前大部分晚期HCC患者无法得到有效治疗［1］。基于癌基因突变或异常表达的分子分型为肿瘤研究提供了新思路。例如靶向EGFR或HER2治疗肺癌和乳腺癌已取得实质性进展［2］。成功的靶向治疗很大程度上依赖于特异性的生物标志物，但HCC的靶向治疗仍缺乏特异性靶点［3］。

人体中主要有四类含YEATS结构域的基因，包括 YEATS4、MELL1、MELL3和YEATS2，其编码的蛋白均与染色体相关复合物有关，如参与组蛋白乙酰转移酶（HAT）复合物和染色质重塑复合物的形成，从而介导表观修饰有关信号通路［4］。YEATS2最早由NAGASE等从胎儿脑cDNA文库中鉴定克隆，最初将其命名为KIAA1197［5］。YEATS2基因编码 Ada-two-A-containing（ATAC）复合物的支架亚基，是HATs复合物的重要组成部分，在组蛋白乙酰化识别过程中起重要作用［6］。但是YEATS2在肿瘤中的报道并不多见，仅在非小细胞肺癌中被报道可能发挥原癌基因作用，在非小细胞肺癌中TEATS2高度扩增，而敲低YEATS2可抑制肿瘤细胞生长、增殖和转移［7］。然而，YEATS2在HCC中的表达及其生物学功能尚不清楚。本研究通过检测HCC患者组织中YEATS2的表达，并分析其与预后的关系，以期为HCC的治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 组织样本来源

收集我院2010年1月至2014年1月手术切除的HCC癌组织和癌旁组织石蜡标本，所有患者均经组织病理学诊断为HCC，排除既往或同时存在其他恶性肿瘤或伴其他肝脏疾病史，术前曾接受放疗、化疗等抗肿瘤治疗以及临床资料不完整的患者。共112例患者符合标准纳入研究。本研究经我院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 资料收集及随访

收集患者性别、年龄、HBsAg、AFP、病理性微卫星灶、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）、门静脉癌栓（portal vein tumor thrombus，PVTT）、肿瘤大小、肿瘤数目、BCLC分期、TNM分期以及Child-Pugh分期等临床病理资料。术后以电话、上门或定期复诊的方式进行随访，统计患者复发、转移以及死亡时间。总生存期（overall survival，OS）定义为自手术到患者死亡的时间；无病生存期（disease free survival，DFS）为从手术到复发或疾病进展导致患者死亡的时间。

1.3 主要材料和试剂

TRIzol、反转录试剂盒购自 Invitrogen公司，YEATS2抗体（24717-1-AP）购自Proteintech公司，PCR引物由Invitrogen公司合成，SYBR Green（04913914001）购自 Roche公司，兔抗羊二抗（P0448）、DAB染色液（K3468）购自DakoReagent公司。

1.4 Real-time PCR检测YEATS2 mRNA的表达

液氮处理HCC癌组织及癌旁组织并研磨后，加入TRIzol Reagent提取总RNA，逆转录为cDNA。反应体系：cDNA 1 μL，上/下游引物混合物 1 μL，2×SYRB Green Master 5 μL，ddH2O 3 μL。YEATS2 引物序列：上游为 5′-AGAACAGCGGAATGCTGATCT-3′，下游为5′-CCATCCACTTATGAGTTGACTGG-3′；β-actin 内参引物序列：上游为5′-AATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′，下游为 5′-ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT-3′。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸35s，40个扩增循环；72℃终末延伸10min。数据经内参 β-actin 标准化处理后以-ΔCt［ΔCt-ΔCt（Max）］表示实验组（癌）和对照组（癌旁）中mRNA的相对表达情况。

1.5 Western blot检测YEATS2蛋白表达

用IP裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒进行定量分析后，加入SDS上样缓冲液100℃变性，冰浴3 min后行SDS-PAGE蛋白电泳检测YEATS2蛋白表达。

1.6 免疫组化检测YEATS2蛋白表达

石蜡切片于37℃过夜后，60℃烤1 h，自动脱蜡机脱蜡后3%双氧水室温浸泡20 min，ddH2O洗3次×5 min，高压碱性修复后室温冷却，ddH2O洗3次×5 min，1% BSA 37℃封闭30 min，加入YEATS2一抗4℃过夜，室温复温 15 min，PBS洗 4次×5 min，加入兔二抗，在37℃下继续孵育30 min，PBS洗4 次×5 min，DAB 显色液（A∶B=1∶50）显色至出现砖红色，ddH2O中终止显色，苏木素复染7～10 min，冲洗后分化，自来水冲洗返蓝20～30 min，晾干脱水透明封片。

ScanScope XT（Aperio Technologies，Vista，CA）扫描切片后，用Aperio Positive Pixel Count Algorithm程序评定染色强度，以［lg（255/平均强度）］×阳性率计算染色强度，其中平均强度=（弱阳性Pixel总强度+阳性Pixel总强度+强阳性Pixel总强度）/（弱阳性Pixel数量+阳性Pixel数量+强阳性Pixel数量），阳性率=染色阳性总数/（染色阳性数+染色阴性数）。根据癌（T）和癌旁（N）染色强度评分，以log2（T/N）表示YEATS2的相对表达。

1.7 免疫荧光染色检测YEATS2在HCC中的表达

添加二抗前操作同免疫组化染色，暗房中用荧光兔二抗室温孵育1 h，PBS洗4次×5 min，DAPI孵育10 min，PBS洗4次×5 min，吸去片上液体用含抗荧光淬灭的封片剂封片，在荧光显微镜下采集图像。

1.8 TCGA数据分析

TCGA原始数据从cBioPortal官网（https：//www.cbioportal.org/）获取。下载 HCC（TCGA，Firehose Legacy）原始数据，其中有临床信息442例，有RNA-seq信息373例。去除混合性肝癌、无预后信息以及ID不匹配63例，共310例患者纳入预后分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差表示，采用配对t检验检测配对数据差异，计数资料组间比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier法估计生存率，生存曲线组间比较log-rank检验。采用Cox回归模型分析YEATS2表达与HCC患者预后的关系，将单因素Cox回归分析差异有统计学意义的因素和对预后有影响的临床因素纳入多因素Cox回归分析。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YEATS2在HCC癌组织及癌旁组织中的表达

Real-time PCR检测结果显示，54对HCC癌组织中YEATS2mRNA的表达较癌旁组织上调（P<0.001，图1A）；GEPIA在线分析显示，HCC癌组织中YEATS2 mRNA表达水平高于正常肝组织（图1B）；Western blot检测18对HCC癌及癌旁组织中YEATS2蛋白表达，结果显示YEATS2在约66.67%（12/18）的HCC癌组织中表达高于癌旁组织（图1C）；免疫组化染色分析结果显示，约71.43%（80/112）的HCC患者YEATS2表达上调（图1D）。

2.2 YEATS2主要在细胞核中表达

免疫组化染色结果显示，YEATS2主要在HCC癌组织和癌旁组织的细胞核中表达（图2A）；免疫荧光染色检测也表明，YEATS2主要在HCC癌组织的细胞核中表达（图2B）。

图2 YEATS2在HCC癌组织细胞核中表达Fig.2 Expression of YEATS2 in the nucleus of HCC tissues

2.3 YEATS2与HCC患者临床病理特征的关系

112例HCC患者中YEATS2表达仅与TNM分期有关（P<0.001），与性别、年龄、HBsAg、AFP、病理性微卫星、MVI侵犯、PVTT、肿瘤大小、肿瘤数目、BCLC分期以及Child-Pugh分期等无关（P＞0.05），见表1。

表1 YEATS2表达与HCC患者临床病理特征的关系Tab.1 Correlation between YEATS2 expression and clinicopathological characteristics of HCC patients

2.4 YEATS2表达与HCC患者预后的关系

单因素Cox回归分析显示，AFP、病理性微卫星灶、MVI、PVTT、肿瘤数目、BCLC 分期、TNM 分期以及YEATS2表达与患者OS有关（P＜0.05）；多因素Cox回归分析显示，存在病理性微卫星灶、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和YEATS2高表达是影响预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表 2。

Kaplan-Meier生存分析显示，YEATS2高表达组患者 OS 更短（HR=2.240，95% CI：1.423～3.529，P=0.001），且更容易复发（HR=2.033，95% CI：1.284～3.219，P=0.002），见图3A～B。TCGA数据库HCC队列分析结果显示，YEATS2高表达的HCC患者OS更差（HR=1.751，95% CI：1.107～2.770，P=0.017），但与 DFS 不具有相关性（HR=1.251，95% CI：0.922～1.696，P=0.150），见图3C～D。

对病理性微卫星灶和TNM分期进行亚组分析，结果显示，YEATS2高表达合并存在病理性微卫星灶或TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的患者总体生存低于其他亚组患者，见图4。

3 讨论

组蛋白转录后修饰（posttranslational modification，PTM）在真核生物基因组的表达、维持和复制中至关重要［8］。组蛋白发生转录后修饰之后，需招募特定的阅读蛋白（reader）至染色体上而引发下游信号转导（如基因转录、DNA复制和修复等）［9］。研究发现YEATS结构域是一类新的组蛋白修饰阅读器［10-11］。已证实人类含YEATS结构域蛋白在多种癌症的发生发展过程中扮演原癌基因角色［7，12-15］，其中YOU 等报道YEATS4/TCEA1/DDX3轴在HCC发生发展中起重要作用［16］。但在不同癌症中，YEATS结构域识别组蛋白转录后修饰的位点不尽相同。如在非小细胞肺癌中YEATS4主要识别组蛋白H3K27ac或 H3K14ac［17］，YEATS2 则与组蛋白 H3K27ac 或H3K27cr位点结合发挥生物学功能［7，18］。目前，已根据YEATS结构域的不同特征，开发出不同的靶向抑制剂，如靶向MLLT1的XL-13［19］以及同时靶向MLLT1和MLLT3的小分子抑制剂——SGC-iMLLT［20］。

人YEATS2基因位于3q27.1，蛋白质含1 422个氨基酸，分子量约为150 kDa。YEATS功能结构域位于220～325个氨基酸间，可介导YEATS2对特定修饰位点的识别，C端含有一段由约90个氨基酸序列的折叠结构域，可招募其他ATAC复合物定位靶基因启动子区域［6］。MI等［7］报道在 H1299、A549 细胞系突变YEATS2的YEATS结构域后，细胞整体乙酰化水平下调，癌细胞增殖、侵袭和转移能力下调；进一步分析TCGA数据库数据发现YEATS2在肺鳞状细胞癌（56%）、卵巢浆液性囊腺癌（27%）头颈部鳞状细胞癌（23%）等多种癌症中存在扩增情况。提示YEATS2可能在癌症中发挥着重要作用。本研究分析了YEATS2 mRNA和蛋白在HCC中的表达情况，发现与癌旁组织相比，YEATS2在HCC癌组织中显著高表达，提示YEATS2可能与HCC的发生有关。进一

步进行组织染色分析发现，YEATS2高表达与患者不良预后相关，且主要定位于细胞核中。亚组分析发现，联合YEATS2高表达和病理性微卫星阳性或TNMⅢ～Ⅳ期可区分出预后更差的HCC患者。这些结果提示YEAST2可作为新的治疗靶点，为HCC临床治疗提供新策略。

表2 HCC患者总生存期的Cox单因素分析和多因素分析Tab.2 Univariable and multivariable analysis of OS of hepatocellular carcinoma patients

图3 YEATS2表达与HCC患者预后的关系Fig.3 The correlation between YEATS2 expression and prognosis of HCC patients

图4 HCC患者中病理性微卫星灶和TNM分期亚组分析的生存曲线Fig.4 The survival curves of pathological microsatellite focus and TNM stage subgroup analysis in patients with HCC

本研究存在以下局限性：⑴本研究为单中心小样本分析，还需进一步的多中心大样本临床分析验证；⑵需进一步的功能实验验证YEATS2的功能，如对HCC细胞系增殖、侵袭和迁移等能力的影响；⑶YEATS2参与HCC的具体作用机制仍需进一步探索。