miR-1271-5p在胃癌组织的表达及对胃癌AGS细胞生物学行为的影响

潘珊 周洪靖 刘爱群 葛莲英

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院内镜中心

胃癌是全球第五大恶性肿瘤，也是癌症死亡的第三大原因［1］。但早期胃癌缺乏典型的症状，大多数胃癌患者确诊时已为晚期，5年生存率不足50%，其中胃癌腹膜转移是造成患者预后较差的重要因素［2-3］。因此，寻找可用于早期诊断的靶点及阐明胃癌转移发生的机制具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一类小的非编码RNA分子，作为基因表达的内源性抑制剂起作用，通过与靶基因的3′-非翻译区（UTR）结合而负调节基因表达，从而抑制翻译和诱导靶基因mRNA降解［4］。已有研究报道 miR-1271-5p在肝癌［5］、结肠癌［6］和骨肉瘤［7］中低表达并发挥抑癌作用，可能是潜在的诊断和预后生物标志物。本团队前期进行在线生物信息学数据库检测，亦发现miR-1271-5p在胃癌中低表达，推测miR-1271-5p可能参与胃癌的发生发展。因此，本研究检测miR-1271-5p在胃癌组织和不同胃癌细胞中的表达水平，观察过表达miR-1271-5p对胃癌细胞生长、侵袭等生物学功能的影响，以期阐明胃癌转移机制及为早期诊断提供可靠的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 临床样本

收集2011年6月至2014年6月广西医科大学附属肿瘤医院90例手术切除胃癌组织及相应癌旁组织，将样品保存在-80°C下。本研究经广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 细胞系和主要试剂

人正常胃黏膜上皮细胞GES1和胃癌细胞SGC-7901、AGS和MGC-803均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清（FBS）、DMEM培养基购自美国Gibco公司，miRNA模拟物和GP-siRNA-Mate Plus购自苏州GenePharma股份有限公司。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。Mir-XTMmiRNA First-Stand Synthesis Kit和SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）试剂盒购自美国TaKaRa公司。Cell Counting Kit-8购自日本同仁公司。

1.3 细胞培养及转染

人正常胃黏膜上皮细胞系GES1和人胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、AGS均用含10%胎牛血清及1%青链霉素的DMEM完全培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养，每1～3 d用EDTA-胰蛋白酶消化液消化、传代。

参照GP-siRNA-Mate Plus转染试剂说明书进行转染实验。取对数生长期细胞，分别转染miR-1271-5p mimics和miR-NC，记为过表达miR-1271-5p组和阴性对照组。将miRNA溶解于Opti-MEM培养基中孵育10 min，同时另取 GP-siRNA-Mate Plus加入Opti-MEM培养基中孵育5 min，混合后室温静置 15 min。将混合物加入各组细胞中，24 h后更换完全培养基，用qRT-PCR验证转染效率。

1.4 CCK-8实验检测细胞增殖能力

取转染24 h后的两组细胞接种于96孔板中，每组 5 个复孔，分别于 24 h、48 h、72 h、96 h 后加入CCK-8工作液10 μL/孔，常规培养2 h后在酶标仪上测定450 nm波长处的吸光度（OD）值。以上实验重复3次。

1.5 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

取转染24 h后计数两组细胞，充分吹匀至单个悬浮细胞，以500/孔接种至预先加入5 mL完全培养基的6孔板中，每组3个复孔，混匀；2周后弃培养基，用PBS浸洗3次，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色1 h，风干后拍照。以上实验重复3次。

1.6 qRT-PCR检测miR-1271-5p的表达

采用TaKaRa公司Mir-XTMmiRNA First-Stand Synthesis Kit逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。按试剂盒说明书建立反应体系，以U6为内参进行相对定量分析。miR-1271-5p上游引物为5′-TTTGGCACTAGCACATTTTTGCT-3′，miR-1271-5p 下游引物为 5′-CTTGGCACCTAGCAAGCACTCA-3′；U6 上游引物为 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，U6下游引物为 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。qRT-PCR采用ABI7500实时PCR检测系统进行分析，反应条件：95 ℃ 10 s，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。采用2-△△Ct法分析各个样品的相对表达量。以上实验重复3次。

1.7 Transwell检测细胞迁移、侵袭能力

转染24 h后，细胞重悬浮于不含血清的培养基，分别加入Transwell和涂有Matrigel的Transwell上室中（100 μL，4×104/孔）。将含有20% FBS的600 μL培养基作为化学引诱剂加入底室中。细胞在37℃，5% CO2下孵育24 h。用4%多聚甲醛固定40 min，Giemsa染色30 min，PBS洗涤3次，光学显微镜拍照。采用Image J软件计数迁移及侵袭细胞的数量。以上实验重复3次。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，miR-1271-5p 表达水平在癌组织和相应癌旁组织的差异比较采用配对t检验；miR-1271-5p与患者临床病理特征的关系分析采用独立样本t检验；miR-1271-5p在不同胃细胞中的表达差异采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，进一步的多重比较采用 Dunnett′s t检验。采用Kaplan-Meier法计算生存率，组间生存曲线的比较采用Log-rank检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-1271-5p在胃癌组织中的表达

qRT-PCR检测结果显示，90例胃癌组织中miR-1271-5p的表达水平低于相应癌旁正常组织（2.544±0.210 vs 4.427±0.340，t=-6.010，P＜0.001），见图 1A；且miR-1271-5p高表达患者中位生存期较低表达患者延长（42个月 vs 36个月，P=0.024），见图1B。

图1 miR-1271-5p在胃癌组织中的表达及与胃癌患者生存的关系Fig.1 Expression of miR-1271-5p in gastric cancer tissues and its relationship with survival in patients with gastric cancer

2.2 miR-1271-5p与胃癌患者临床病理特征的关系

在 90例患者中，T2～T3和N0～N1患者 miR-1271-5p表达量分别较相应的T4患者和N2～N3患者升高（P＜0.05），Ⅰ～Ⅱ期患者 miR-1271-5p表达量高于Ⅲ～Ⅳ期患者（P=0.028），不同年龄、性别、分化程度、肿瘤大小和有无远处转移患者miR-1271-5p表达量差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 miR-1271-5p表达与胃癌病患者临床病理特征的关系（±s，n=90）Tab.1 Correlation between the expression of miR-1271-5p and clinicopathological features in patients with gastric cancer（±s）

表1 miR-1271-5p表达与胃癌病患者临床病理特征的关系（±s，n=90）Tab.1 Correlation between the expression of miR-1271-5p and clinicopathological features in patients with gastric cancer（±s）

Characteristic n miR-1271-5p expression level t P Age（year）＜60 39≥60 51 Gender Male 42 Female 48 Differentiation Low 66 Moderate or well 24 Tumor size（cm）≤4 41＞4 49 T status T2～T3 31 T4 59 N status N0-N1 43 N2-N3 47 Distant metastasis M0 85 M1 5 TNM stageⅠ-Ⅱ 25Ⅲ-Ⅳ 65 3.737 0.305 1.031±2.048 3.662±1.972 0.273 1.091 1.195±2.090 3.933±2.044 0.675 0.586 2.309±1.566 1.884±2.655 0.587 0.321 0.928±1.998 3.540±1.939 0.376 0.009 3.920±1.710 1.293±0.658 0.146 0.042 3.134±1.577 0.941±0.405 0.302 0.792 1.896±1.419 4.932±3.575 1.695 0.028 3.919±1.711 1.129±0.660

2.3 miR-1271-5p在不同胃细胞中的表达情况

qRT-PCR检测结果显示，人正常胃黏膜上皮细胞 GES1，胃癌细胞SGC7901、AGS和MGC-803中miR-1271-5p的表达水平差异有统计学意义（F=8714.536，P＜0.001）。人正常胃黏膜上皮细胞GES1比较，胃癌细胞SGC7901、AGS和MGC803的miR-1271-5p表达水平均降低（均P＜0.01），其中AGS细胞表达水平最低，因此选取该细胞株进行后续的功能实验，见图2。

图2 miR-1271-5p在不同胃癌细胞和人正常胃黏膜上皮细胞中的表达Fig.2 Expression of miR-1271-5p in different gastric cancer cell lines and normal gastric mucosal epithelial cell lines

2.4 miR-1271-5p在胃癌AGS细胞中的表达

转染24 h后，采用qRT-PCR验证其转染效率，结果显示过表达miR-1271-5p组中miR-1271-5p相对表达量高于其阴性对照组，差异有统计学意义（18.27±0.02 vs 1.001±0.002，t=846.200，P<0.001），见图3。

图3 miR-1271-5p在胃癌AGS细胞中的表达Fig.3 Expression of miR-1271-5p in gastric cancer AGS cells

2.5 过表达miR-1271-5p对胃癌AGS细胞增殖能力的影响

CCK-8实验结果显示，转染48 h、72 h及120 h后，过表达miR-1271-5p组细胞OD值均低于其阴性对照组，差异均有统计学意义（0.280±0.012 vs 0.358±0.003，t=6.270，P=0.011；0.641±0.021 vs 0.758±0.015，t=4.498，P=0.003；1.184±0.011 vs 1.624±0.022，t=17.910，P<0.001），见图 4。

图4 过表达miR-1271-5p对胃癌AGS细胞增殖的影响Fig.4 Effect of miR-1271-5p overexpression on proliferation of gastric cancer AGS cells

2.6 过表达miR-1271-5p对胃癌AGS细胞克隆形成能力的影响

平板克隆形成实验结果显示，过表达miR-1271-5p组细胞克隆数量较阴性对照组少，差异有统计学意义［（47±4）个 vs（100±4）个，t=9.435，P<0.01）］，见图5。

图5 过表达miR-1271-5p对胃癌AGS细胞克隆形成的影响Fig.5 Effect of miR-1271-5p overexpression on colony formation of gastric cancer AGS cells

2.7 过表达miR-1271-5p对胃癌AGS细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，过表达miR-1271-5p组细胞迁移数量较其阴性对照组少［（279±8）个vs（385±11）个，t=7.677，P=0.002］，侵袭数量亦低于其阴性对照组［（176±8）个 vs（302±8）个，t=11.220，P<0.001］，见图 6。

图6 过表达miR-1271-5p对胃癌AGS细胞迁移和侵袭能力的影响Fig.6 Effect of miR-1271-5p overexpression on migration and invasion ability of gastric cancer AGS cells

3 讨论

侵袭和转移是胃癌最主要的生物学特征，也是导致治疗失败和患者死亡的主要原因，因此阻止胃癌侵袭和转移是改善预后的关键。而寻找参与胃癌形成和进展的分子可能有助于其诊断和治疗［8-9］。miRNAs在正常和病理情况下通常起基因转录后调控作用，进而影响细胞增殖、分化、凋亡和侵袭等生物学行为，目前关于肿瘤复发和转移相关的miRNAs表达谱研究也成为研究热点之一［10］。miR-1271-5p是一种miR-96旁系同源物，在人类非神经元组织中以低拷贝数被发现，编码于ARL10基因的第二个内含子中［11-12］。研究证实miR-1271-5p在包括胃癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、肝细胞癌等细胞中表达下调，且通过调控相应靶基因，发挥抑癌作用。在肾细胞癌细胞研究中发现miR-1271-5p过表达可抑制细胞增殖并诱导其凋亡，且主要通过调控DOCK1基因实现［13］；miR-1271也可通过靶向CDK1降低子宫内膜癌细胞增殖能力，并促进细胞凋亡［14］；还可通过调控miR-1271-5p/FOXK2/AKT轴抑制肝细胞癌细胞生长和迁移［15］。而在胃癌细胞MGC-803中miR-1271过表达可抑制细胞增殖、迁移、侵袭并减弱细胞的上皮-间质转化能力；在胃癌细胞SGC-7901中抑制miR-1271表达则作用相反，由此可见miR-1271在胃癌细胞中发挥抑癌作用［16］。在胃癌组织中亦发现，在年龄较大，肿瘤较大，有淋巴结转移和远处转移，Ⅲ-Ⅳ期和分化程度低的患者中miR-1271的表达水平较低，且miR-1271高表达的患者总生存率高于低表达患者［17］。本研究采用qRTPCR方法检测90例胃癌患者的癌组织及其相应癌旁组织中miR-1271-5p的表达，结果显示miR-1271-5p在胃癌肿瘤组织中表达下调，且miR-1271-5p低表达与肿瘤浸润程度、淋巴结转移和肿瘤分期等不良临床特征有关，miR-1271-5p高表达患者的生存期较低表达患者延长，与上述研究结果一致，提示miR-1271-5p可能在胃癌的发生和进展中起抑癌基因的作用。

为进一步观察miR-1271-5p对胃癌进展的影响，本研究首先采用qRT-PCR检测人胃癌细胞系（SGC-7901、MGC-803、AGS）和人正常胃黏膜上皮细胞系GES1中miR-1271-5p的表达，发现相较于人正常胃黏膜上皮细胞系GES1，miR-1271-5p在3个胃癌细胞系中均低表达，且AGS细胞表达量最低，因此选取该细胞株进行后续的功能实验。利用瞬时转染法成功建立过表达miR-1271-5p的胃癌AGS细胞系，发现过表达miR-1271-5p可抑制细胞增殖、迁移、侵袭能力，进一步验证了miR-1271-5p在胃癌发生、发展中可能发挥抑癌作用。

本研究表明，miR-1271-5p在胃癌组织及细胞系中低表达，miR-1271-5p过表达可抑制胃癌细胞的增殖、侵袭及转移，在胃癌中发挥抗肿瘤作用。miR-1271-5p有望成为胃癌诊断和治疗的新靶点，但具体作用机制仍有待进一步深入研究。