伊维菌素上调自噬水平抑制犬乳腺肿瘤细胞的增殖

刁洪秀,程 楠,张 迪,林德贵

(中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

乳腺肿瘤是犬最常见的自发性肿瘤，尤其是在未绝育的母犬中发病率更高[1-2]。单纯的手术切除治疗无法治愈该疾病，其较高的复发率和转移率使其预后很差。自噬作为肿瘤研究热点，已证实可参与肿瘤发生发展的多个阶段，并诱导异常细胞的凋亡[3-4]。因此，诱导癌细胞自噬为抗肿瘤药物的研发提供了新的方向[5]。伊维菌素(Ivermectin)是一种常用的抗寄生虫药物，近期的研究发现伊维菌素在多种人类肿瘤中发挥抗肿瘤活性[6-8]，但在犬乳腺肿瘤中尚未见到相关报道。本研究旨在探讨伊维菌素对犬乳腺肿瘤细胞的杀伤作用，对细胞凋亡、自噬水平的影响及可能机制，为其在兽医临床肿瘤中的研究和应用提供实验室数据公司。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 犬乳腺肿瘤细胞系CMT 7364(本实验室保存)，CIPp(日本东京大学馈赠)。

1.1.2 药物与试剂 伊维菌素，购自Sigma公司；胎牛血清、胰酶、DMEM培养基，均购自美国Gibco公司；CCK8试剂盒，购自日本东仁公司；annexinV-FITC/PI 双染流式细胞术检测试剂盒，购自BD公司；pEGFP-LC3质粒由中国农事医学科学院军事兽医研究所夏咸柱院士实验室馈赠；转染试剂Lipo3000，购自Invitrogen公司；Anti-β-Tubulin antibody，购自Sigma公司；Anti-LC3B antibody、羊抗兔IgG/HRP及羊抗小鼠IgG/HRP，均购自Proteintech公司。

图3 伊维菌素与犬乳腺肿瘤细胞自噬的关系
Fig.3 The effect of ivermectin on autophagy in canine mammary tumor cells
A：荧光显微镜下pEGFP-LC3蛋白表达(标尺=50 μm)； B：单个细胞内pEGFP-LC3绿色荧光颗粒数
A: The expression of pEGFP-LC3 by fluorescence microscope (Scale bar = 50 μm); B: The amounts of autophagosomes per cell

1.1.3 仪器 Elx酶标仪(Bio Tek)，流式细胞仪(Becton Dickinson Bioscience)，荧光倒置显微镜(OLYMPUS)，细胞培养箱(Thermo)，双人面垂直工作台(苏州净化)，电泳仪(BIO-RAD)，化学发光成像系统(Tannon)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 CMT 7364和CIPp细胞系接种于含10%胎牛血清和100单位/mL的青霉素链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖率 将CMT 7364和CIPp细胞系按照1×104个细胞/孔接种于96孔板，恒温培养12 h待细胞贴壁后，分别加入100 μL终浓度为4、8、12、20 μmol/L和 40 μmol/L的伊维菌素，阴性对照为1% DMSO(Control)，阳性对照为10 μg/mL顺铂(Cisplain)，每个处理3个重复，于12、24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h，450 nm处测定吸光度，计算细胞增殖率和IC50。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡水平 将CMT 7364和CIPp细胞系按照1×105个细胞/孔接种于6孔板，培养过夜后，加入终浓度为12 μmol/L的伊维菌素，处理24 h和48 h后收集所有细胞，1 500 r/min离心5 min，PBS洗2次，参照annexinV-FITC/PI 双染试剂盒说明书进行染色，200目细胞筛过滤，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4 荧光显微镜下细胞自噬的观察 将CMT 7364和CIPp细胞系按照1×105个细胞/孔接种于6孔板，待细胞融合至80%时，应用Lipo3000转染质粒pEGFP-LC3，12 h后加入终浓度为4 μmol/L和8 μmol/L 的伊维菌素，处理24 h，于显微镜下观察并采集图像，计算5个视野下细胞浆内自噬颗粒的数目，计算单个细胞内自噬颗粒数。

1.2.5 Western Blot 检测自噬相关蛋白的表达 将CMT 7364和CIPp细胞系按照2×105个细胞/孔接种于6孔板，培养过夜后，加入终浓度为8 μmol/L和12 μmol/L的伊维菌素，处理24 h和48 h后，收集细胞，用含1% PMSF 的 RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min，4 ℃,12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA测定蛋白浓度。按每孔20 μg上样，12% SDS -PAGE电泳后，转移至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭1 h。4 ℃孵育一抗LC3B(1∶2 000)、β-Tublin(1∶2 000)过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)1 h，ECL 化学发光试剂显色后Tannon凝胶成像系统拍照。

1.3 统计学分析 应用SPSS 18.0软件对数据进行t检验和方差分析，数据以平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 伊维菌素抑制犬乳腺肿瘤细胞的增殖 用不同浓度伊维菌素处理犬乳腺肿瘤细胞12、24 h和48 h后，细胞的增殖率如图1所示，随着药物浓度的升高和作用时间的延长，细胞增殖率逐渐下降，除最低剂量4 μmol/L外，2种细胞在伊维菌素处理后的增殖率显著低于对照组(P<0.05)。CMT 7364在12、24 h和48 h的IC50分别为12.74、10.20 μmol/L和6.90 μmol/L，CIPp在12、24 h和48 h的IC50分别为15.65、10.76 μmol/L和8.38 μmol/L。

图1 伊维菌素抑制犬乳腺肿瘤细胞增殖
Fig.1 Ivermectin inhibits the growth of canine mammary cancer cells*：P<0.05

2.2 伊维菌素对犬乳腺肿瘤细胞凋亡水平的影响 流式细胞术检测细胞凋亡水平可发现，伊维菌素对细胞凋亡水平影响轻微(见图2)。其中CMT 7364细胞在24 h和48 h凋亡百分比分别为(0.50±0.19)%和(0.79±0.20)%，CIPp细胞在24 h和48 h凋亡百分比分别为(0.49±0.20)%和(2.34±1.75)%。在伊维菌素处理后的48 h，尽管2种细胞的凋亡百分比显著高于对照组(P值分别为0.000和0.012)(图2 B)，但细胞凋亡比例均小于3%。

图2 伊维菌素与犬乳腺肿瘤细胞凋亡的关系
Fig.2 The effect of ivermectin on apoptosis in canine mammary tumor cellsA：流式细胞术检测细胞凋亡水平结果； B：细胞凋亡比例统计结果 *:P<0.05; **:P<0.01; 下图同 A: Apoptosis in canine mammary tumor cells by flow cytometry; B: The percentage of apoptosis cells *:P<0.05, **:P<0.01. The same as below

2.3 伊维菌素诱导犬乳腺肿瘤细胞生成自噬小体 伊维菌素处理24 h后可明显见到细胞胞浆内pEGFP-LC3绿色荧光颗粒数目增多，并呈现剂量依赖性关系(见封二彩版图3 A)。单个细胞内荧光颗粒数统计后发现，伊维菌素8 μmol/L处理后细胞胞浆内的自噬颗粒数目要显著高于对照组(P值分别为0.006和0.000)(见封二彩版图3 B)。

2.4 伊维菌素对犬乳腺肿瘤细胞内自噬相关蛋白表达的影响 如图4所示，随着伊维菌素浓度的升高和作用时间的延长，细胞内LC3蛋白表达明显上调，同时可促进LC3Ⅰ蛋白向LC3Ⅱ蛋白的转化，促进细胞自噬的发生。

3 讨论

伊维菌素是常用的大环内酯类药物，其通过阻断寄生虫氯离子通道发挥作用[9]。近期研究发现，伊维菌素可通过多种途径发挥抗肿瘤作用，如抑制WNT-TCF信号通路、调节PAK1以及诱导线粒体功

图4 伊维菌素对细胞内自噬相关蛋白表达的影响
Fig.4 The effect of ivermectin on autophagy markers in canine mammary tumor cells

能障碍[6-8]。伊维菌素在兽医临床广泛应用，但在动物肿瘤方面尚未见报道。本试验首次选择伊维菌素作为靶向肿瘤药物进行研究，探讨其在犬乳腺肿瘤细胞中的作用及可能机制。

体外筛选抗肿瘤药物的第一步即细胞活性测定，本研究中选择CCK-8法检测伊维菌素体外对犬乳腺肿瘤的杀伤作用。结果显示，伊维菌素可显著抑制犬乳腺肿瘤细胞的增殖，并呈现时间与剂量依赖性关系(图1)。为了进一步探究伊维菌素抑制肿瘤细胞增殖的机制，我们进行了细胞凋亡和自噬水平的检测。结果显示，尽管在伊维菌素处理后细胞凋亡比例有所上升，但均小于3%(图2)，说明伊维菌素抑制肿瘤细胞增殖的机制与凋亡关系不大，黄灿华等[7]的研究也证实了这一点。然而，在伊维菌素处理后细胞内自噬水平变化很明显，细胞浆内pEGFP-LC3绿色荧光颗粒数目明显增多(中插彩版图3A)，且与伊维菌素浓度呈正相关，提示伊维菌素诱导细胞发生了自噬。Western Blot试验进一步证实了这一发现，在伊维菌素处理后细胞内LC3蛋白的表达明显上调，同时促进LC3Ⅰ蛋白向LC3Ⅱ蛋白的转化(图4)。自噬广泛存在于真核细胞中，在肿瘤的发生、发展以及肿瘤治疗中扮演重要角色[10-11]，而LC3是自噬体标记蛋白，LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值的降低是判断自噬发生的标志[12]。本研究结果提示，伊维菌素对犬乳腺肿瘤细胞的抑制作用与诱导细胞自噬有关。

自噬是一个复杂的机制，有研究称自噬在肿瘤形成的早期起抑制作用，在肿瘤形成后促进肿瘤的生长和转移[10]，但其具体的作用机制尚存在争议。在本研究中，伊维菌素通过诱导抑制犬乳腺肿瘤细胞增殖的细胞自噬发挥抗肿瘤作用。

4 结论

伊维菌素通过诱导犬乳腺肿瘤细胞自噬发挥抗肿瘤活性，但其确切的作用机制还有待于进一步研究。